[發(fā)明專利]一種利用熒光各向異性技術檢測赭曲霉毒素A的方法

有效

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• 申請日: 2019-04-24
• 公開（公告）號: CN110117641B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設計）人: 趙強;李亞飄
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 秦夢楠

本發(fā)明公開了一種利用熒光各向異性技術檢測赭曲霉毒素A的方法。本發(fā)明選取了可特異性結合赭曲霉毒素A的核酸適配體，將其采用熒光染料標記；針對該核酸適配體設計了與其互補的單鏈DNA分子，將其采用采用鏈霉親和素標記；所述核酸適配體和單鏈DNA分子結合后，熒光染料和鏈霉親和素在空間上鄰近；將上述制備的核酸適配體和單鏈DNA分子和待測樣本共同反應，通過測定反應體系的熒光各向異性值實現(xiàn)對待測樣本中赭曲霉毒素A的檢測。本發(fā)明建立的方法具有靈敏、簡單、快速、重現(xiàn)性好、易于高通量分析、樣品用量少等優(yōu)點，使用的材料容易制備、合成成本低、穩(wěn)定性好、儲存和運輸方便、貨架壽命長，具有高靈敏度和良好的選擇性。

技術領域

本發(fā)明涉及一種利用熒光各向異性技術檢測赭曲霉毒素A的方法。

背景技術

赭曲霉毒素A(ochratoxin A，簡寫為OTA)是由赭曲霉等幾種青霉屬真菌產生的次級代謝產物，國際癌癥研究機構將其列為2B類致癌物。谷物(小麥、玉米等)、糧食、葡萄、咖啡等經常受到OTA的污染。攝入污染了OTA的食品后，對動物和人體的健康造成嚴重威脅。靈敏、快速檢測OTA在食品安全、質量監(jiān)控、環(huán)境分析，特別是現(xiàn)場分析等具有重要的意義和需求。

常用的檢測赭曲霉毒素A的方法主要包括色譜法、色譜-質譜聯(lián)用、質譜法和免疫分析傳感等。色譜法、質譜法往往需要昂貴的儀器設備，而且操作繁瑣費時。免疫分析需要利用免疫抗體等識別赭曲霉毒素A，免疫分析傳感相對來說較為快速，但抗體的制備成本高，抗體的穩(wěn)定性也不好，容易失活。

核酸適配體(Aptamer)是從寡聚核苷酸文庫中篩選得到的能夠與靶分子高親和力和高特異性結合的單鏈DNA或RNA。在特異性識別功能上，核酸適配體能夠與傳統(tǒng)的抗體相媲美。同時在生物傳感方面，核酸適配體具有一些抗體所不具備的優(yōu)勢。例如，核酸適配體能夠通過低成本的化學合成進行大量制備，很容易在核酸適配體上引入各種功能基團。它具有較高的熱穩(wěn)定性，便于長期儲存和運輸。

相對于其他分析方法如質譜、色譜等，熒光分析技術操作簡單，靈敏，儀器成本低，而且檢測快速。其中熒光各向異性(熒光偏振)分析方法具有不受熒光強度波動影響、重現(xiàn)性好、信號穩(wěn)定、易于高通量分析等優(yōu)勢。熒光各向異性和熒光偏振是針對同一物理現(xiàn)象的不同表述，兩者在計算公式上有差別，兩者可通過適當公式進行相互轉換得到。熒光各向異性和熒光偏振兩種表達都比較常用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種利用熒光各向異性技術檢測赭曲霉毒素A的方法。

本方法的設計原理如下：熒光染料標記的核酸適配體與鏈霉親和素標記的單鏈DNA分子雜交時，核酸適配體與單鏈DNA分子反向互補形成雙鏈，鏈霉親和素靠近熒光染料分子，由于分子體積增大且熒光染料的局部轉動受限，熒光染料標記的適配體產生較高的熒光各向異性(熒光偏振)值。當赭曲霉毒素A時，熒光染料標記的適配體與目標分子結合，不再與鏈霉親和素標記的單鏈DNA分子雜交，此時檢測體系呈現(xiàn)較低的熒光各向異性(熒光偏振)信號。根據信號的降低，可以實現(xiàn)對赭曲霉毒素A的檢測。

本發(fā)明首先提供了一種檢測赭曲霉毒素A的方法，包括如下步驟：將熒光染料標記的核酸適配體、鏈霉親和素標記的單鏈DNA分子和待測樣本共同反應，通過測定反應體系的熒光各向異性(熒光偏振)值實現(xiàn)對待測樣本中赭曲霉毒素A的檢測；

所述核酸適配體能夠特異性結合赭曲霉毒素A；

所述單鏈DNA分子能夠與所述核酸適配體的部分序列反向互補形成雙鏈結構；當形成雙鏈結構后，熒光染料和鏈霉親和素位于雙鏈結構的同一端，兩者在空間上鄰近。

所述方法中，所述“熒光染料和鏈霉親和素位于雙鏈結構的同一端，兩者在空間上鄰近”是通過如下(a1)或(a2)所示的方式實現(xiàn)的：

(a1)當單鏈DNA分子與核酸適配體的自5’末端起部分序列反向互補時，所述熒光染料標記于核酸適配體的5’末端，所述鏈霉親和素標記于單鏈DNA分子的3’末端；