[發明專利]基于CRISPR/Cas9系統在Beta-TC-6細胞株中剔除Sidt2基因方法

在審

• 申請號: 201910331839.6
• 申請日: 2019-04-24
• 公開（公告）號: CN110029130A
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發明（設計）人: 高家林;王李卓;呂康甲;章堯;粱飛騰;張楊
• 申請（專利權）人: 皖南醫學院第一附屬醫院（皖南醫學院弋磯山醫院）
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;C12N9/22;C12N15/66
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了基于CRISPR/Cas9系統在Beta?TC?6細胞株中剔除Sidt2基因方法，針對小鼠胰島素瘤胰島β細胞(Beta?TC?6)難轉染以及CRISPR/Cas9質粒分子較大的特點，通過采取電穿孔進行Cas9質粒的遞送，并設置不同的穿孔電壓梯度進行電轉參數的優化，從而實現了在小鼠胰島素瘤胰島β細胞(Beta?TC?6)中高效的遞送CRISPR/Cas9質粒；同時，通過將CRISPR/Cas9基因編輯系統和電穿孔相結合，克服了CRISPR/Cas9質粒難轉導的特點，為常規的分子生物學實驗室開展CRISPR/Cas9基因基因編輯系統提供了切實可行的辦法，具有極高的推廣應用價值。

技術領域

本發明涉及醫療基因工程領域，尤其涉及基于CRISPR/Cas9系統在 Beta-TC-6細胞株中剔除Sidt2基因方法。

背景技術

CRISPR/Cas9基因編輯系統成為繼鋅指蛋白(ZFPs)、轉錄激活子樣效應因子核酸酶(TALEs)之后的第三代基因編輯技術。與傳統的基因編輯工具相比具有諸多的優點，首先CRISPR/Cas9基因編輯系統適應性和操作性強，來自產膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌的Cas9由于PAM識別序列僅為2個堿基(GG)，幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點。Cas9蛋白在目前測試過的幾乎所有生物和細胞中均有活性，包括細菌、酵母、植物、魚、以及哺乳動物細胞；其次，CRISPR/Cas9 基因編輯系統簡單易學，目前已有多種成熟的CRISPR/Cas9基因編輯系統質粒載體，常規的分子生物學實驗室即可開展構建，只需要將長約25bp左右的sgRNA 雙鏈連接到線性化的載體中，構建難度相對于常見的表達載體和報告基因載體小，構建完成的載體只需要通過菌落PCR或者測序即可鑒定，不必像構建表達載體擔心長片段的堿基突變問題。但是CRISPR/Cas9質粒需要表達cas9蛋白相對于其他的載體偏大，一般常常在10kbp以上，轉染細胞難度較大，尤其對于難轉染細胞更是雪上加霜。雖然可以通過對成功轉染的細胞表達的抗生素篩選或者熒光標記可進行篩選，但是轉染效率低對于后續的篩選和單克隆培養造成很大的困難，并且cas9蛋白具有一定的細胞毒性，后續的抗生素篩選和流式分選也會對轉染成功的細胞也會有影響。因此提高CRISPR/Cas9質粒的轉染效率是急需解決的問題。

目前現有質粒轉染主流的方法包括脂質體轉染、陽離子非脂質體轉染、磷酸鈣轉染等方法。這些方法有各自的優點，同時也存在著缺點。比如脂質體轉染效率高，但是對于一些原代細胞或者難轉染的分泌性的細胞轉染效率較低。電穿孔也稱為電轉染，是通過高強度的電場作用，使細胞膜上形成可逆的瞬時通道，質粒在電場的作用下通過通道進入細胞內。電穿孔轉染相比于其他轉染方法具有操作簡單、對于原代細胞和難轉染細胞效率高、重復性好等優點。但是電穿孔轉染對于不同的細胞系轉染參數差異較大，因此需要針對不同的細胞系進行電轉染參數的優化，目前比較成熟的運用電穿孔的細胞都是常見細胞系或者原代細胞，對胰島細胞系使用電穿孔較少，也沒對其進行電轉染參數進行優化。另外質粒的純度以及濃度、細胞的狀態等都會對電轉的效率產生影響。電轉參數優化時一般在保證轉染質粒純度濃度以及細胞狀態的前提下，通過固定穿孔時間，摸索不同穿孔電壓梯度，以摸索細胞系最優穿孔電壓。

根據上述，本發明針對小鼠胰島素瘤胰島β細胞(Beta-TC-6)難轉染以及 CRISPR/Cas9質粒分子較大的特點，采取電穿孔進行Cas9質粒的遞送，并且設置不同的穿孔電壓梯度進行電轉參數的優化，從而實現了在小鼠胰島素瘤胰島β細胞(Beta-TC-6)中高效的遞送CRISPR/Cas9質粒；同時，本發明通過將 CRISPR/Cas9基因編輯系統和電穿孔相結合，克服了CRISPR/Cas9質粒難轉導的特點，為常規的分子生物學實驗室開展CRISPR/Cas9基因基因編輯系統提供了切實可行的辦法。

發明內容