[發(fā)明專利]基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在Beta-TC-6細胞株中剔除Sidt2基因方法

在審

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• 申請日: 2019-04-24
• 公開（公告）號: CN110029130A
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發(fā)明（設計）人: 高家林;王李卓;呂康甲;章堯;粱飛騰;張楊
• 申請（專利權(quán)）人: 皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院（皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院）
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;C12N9/22;C12N15/66
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在Beta-TC-6細胞株中剔除Sidt2基因方法，具體實驗步驟如下：

(1)、sgRNA oligo DNA序列合成；利用sgRNA在線設計工具針對小鼠Sidt2基因設計長度為20bp左右的oligo DNA，sgRNAssDNA序列F鏈5’端需要添加CACC從而可以和BbsI酶切后的載體互補，需要注意的是F鏈的第一個堿基必須是G，如果選取的Guide序列的第一個堿基不是G，可自行添加一個G以增強U6啟動子的活性，R鏈的5’端添加AAAC。另外，需在位點上下游各設計一條引物，用于后續(xù)檢測陽性克隆，引物能擴增約300bp的DNA片段，上游引物距突變位點約100bp，下游引物距突變位點約200bp。將設計后的序列進行合成，純化級別為PAGE；

(2)、oligo DNA退火：合成的sgRNA稀釋為終濃度為100uM，配制退火反應體系：稀釋的sgRNA各1ul，2ulAnnealing Buffer for DNA Oligos(5X)，用超純水補足到10ul。PCR儀中95℃10分鐘，隨后取出室溫冷卻兩個小時。稀釋10倍后儲存在-20℃?zhèn)溆茫?/p>

(3)、px459重組質(zhì)粒的構(gòu)建：px459質(zhì)粒為含有U6啟動子的sgRNA骨架的表達載體。(A)px459載體的線性化：使用BbsI限制性內(nèi)切酶線性化px459載體，使用膠回收試劑盒回收線性化px459載體。(B)sgRNA與線性化px459連接：按照T4連接酶說明書配置反應體系，PCR中25℃反應3小時。(C)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取菌落搖菌抽提質(zhì)粒；

(5)、px459重組質(zhì)粒的驗證：質(zhì)粒送生物公司測序，測序引物為U6啟動子通用引物，根據(jù)測序結(jié)果鑒定sgRNA是否正確連接到載體中。測序成功的質(zhì)粒命名為px459-Sidt2，使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒抽提質(zhì)粒，要求質(zhì)粒濃度大于1ug/ul并且純度達到電轉(zhuǎn)染要求；

(6)、Beta-TC-6細胞的培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)條件為含15％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，細胞匯合度達到70％左右進行傳代；

(7)、px459-Sidt2質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)前細胞融合度達到80％左右，胰酶消化細胞后加入Opti-MEM使其成為單細胞懸液并且調(diào)整細胞數(shù)量為1x106個/90ul，吸取90ul細胞懸液加入10ul質(zhì)粒輕輕混勻后加入電轉(zhuǎn)杯中。設置導入電轉(zhuǎn)參數(shù)：脈沖電壓為20V，脈沖時間為20ms，脈沖間隔為50ms，脈沖次數(shù)為5次，電壓衰減為40％，電穿孔模式為正方向。穿孔電轉(zhuǎn)參數(shù)為：固定脈沖時間5ms，脈沖間隔50ms，脈沖次數(shù)2次，電壓衰減10％，電穿孔模式為正方向，設置脈沖電壓梯度為125V、150v、175v、200v。完成電轉(zhuǎn)染的細胞在六孔板中培養(yǎng)過夜；

(8)、陽性細胞的篩選：電轉(zhuǎn)染48小時加入嘌呤霉素至終濃度為3ug/ml進行篩選(提前需要進行嘌呤霉素篩選梯度的摸索，本實驗室小鼠胰島素瘤胰島β細胞Beta-TC-6的篩選濃度為3ug/ml)，72小時后換為正常培養(yǎng)條件，擴增凍存；

(9)、T7酶和Western blot檢測：野生型細胞以及陽性細胞一部分使用試劑盒提取DNA，一部分使用細胞裂解液提取全細胞蛋白。提取的DNA通過PCR對sgRNA的靶向區(qū)域進行擴增，擴增引物的退火溫度54℃。(1)T7酶切分析：按照說明書進行操作，酶切后的產(chǎn)物通過2％瓊脂糖凝膠分析。(2)Western blot檢測：使用微量分光光度計測定蛋白濃度，取等量的蛋白加入蛋白上樣緩沖液，煮沸后進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后濕轉(zhuǎn)到PVDF上，用5％的脫脂奶粉封閉一個小時，一抗孵育過夜，第二天進行二抗孵育，加入曝光底物后使用超靈敏多功能成像儀進行曝光，以β-actin作為內(nèi)參；

(10)、px459-Sidt2克隆構(gòu)建：px459空載體經(jīng)BbsI酶切線性化后，從瓊脂糖凝膠中回收酶切后的線性化片段。將退火的sgRNA雙鏈和回收的線性化px459載體相連，構(gòu)建px459-Sidt2重組質(zhì)粒。構(gòu)建的px459-Sidt2經(jīng)測序表明插入序列的位置、方向均正確，重組質(zhì)粒px459-Sidt2構(gòu)建成功；

(11)、T7E1酶及Western blot檢測小鼠Sidt2基因的敲除效果：T7E1酶結(jié)果顯示，電轉(zhuǎn)染px459-Sidt2的混合克隆細胞有一條明顯的切開的條帶，即混合克隆細胞中出現(xiàn)堿基錯配，表明px459-Sidt2在Beta-TC-6細胞中實現(xiàn)靶向敲除。Western blot檢測敲除效果，結(jié)果顯示同野生型細胞比較，混合克隆細胞Sidt2蛋白表達顯著降低(t＝6.668，P＝0.0026)。進一步實驗需要進行單克隆培養(yǎng)，從而得到敲除效率為100％的克隆細胞株。