[發(fā)明專利]一種腹瀉性貝毒大田軟海綿酸熒光檢測試紙及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910330343.7
• 申請日: 2019-04-23
• 公開（公告）號: CN110018145B
• 公開（公告）日: 2022-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盧士英;王菡;王洋;李巖松;任洪林;胡盼;柳增善;周玉;曹旗;鄭宇
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 西安銘澤知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61223
• 代理人: 俞曉明

1.一種利用腹瀉性貝毒大田軟海綿酸熒光檢測試紙檢測樣品的方法，其特征在于，所述腹瀉性貝毒大田軟海綿酸熒光檢測試紙包括底板(1)，所述底板(1)上從左到右依次固接有加樣墊(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)，所述加樣墊(2)靠近所述硝酸纖維素膜(3)的一端疊加且固接在所述硝酸纖維素膜(3)一端上，所述吸水墊(4)靠近所述硝酸纖維素膜(3)的一端疊加且固接在所述硝酸纖維素膜(3)的另一端上，所述硝酸纖維素膜(3)上從左到右依次設(shè)置有檢測帶(5)和參照帶(6)；

所述檢測帶(5)由大田軟海綿酸-蛋白質(zhì)偶聯(lián)復(fù)合物噴射在所述硝酸纖維素膜(3)上，干燥后形成，其中大田軟海綿酸-蛋白質(zhì)偶聯(lián)復(fù)合物濃度為0.4mg/mL，按1μL/cm的量劃膜；所述參照帶(6)由抗小鼠二抗噴射在所述硝酸纖維素膜(3)上，干燥后形成，其中抗小鼠二抗?jié)舛葹?.4mg/mL，按1μL/cm的量劃膜；

所述大田軟海綿酸-蛋白質(zhì)偶聯(lián)復(fù)合物是將大田軟海綿酸與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后得到的，所述蛋白質(zhì)為人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA；

所述大田軟海綿酸-蛋白質(zhì)偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法如下：

步驟(1)，將大田軟海綿酸溶于N-二甲基甲酰胺中，加入預(yù)先配置好的0.1mg/μL N-羥基琥珀酰亞胺溶液及N，N-二環(huán)已基碳二亞胺溶液，加入ddH₂O，旋渦震蕩混勻；大田軟海綿酸、N-二甲基甲酰胺、N-羥基琥珀酰亞胺、N，N-二環(huán)已基碳二亞胺、ddH₂O的比例為1mg：50μL：1.55μL：2.85μL：45.6μL；

步驟(2)，室溫25-28℃震蕩孵育2-2.5h；

步驟(3)，將步驟(2)孵育好的混合液逐滴加入到等體積蛋白溶液中，所述蛋白溶液為人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA溶于0.1M NaHCO₃溶液中制備得到的；

步驟(4)，室溫25-28℃震蕩孵育2-2.5h，得到偶聯(lián)物；

步驟(5)，用30kDa的離心超濾管超濾離心步驟(4)得到的偶聯(lián)物，收集濾液，得到含有偶聯(lián)復(fù)合物的溶液；將偶聯(lián)復(fù)合物溶液用0.01M pH7.4 PBS溶解，得到OA-蛋白質(zhì)偶聯(lián)復(fù)合物；采用人免疫球蛋白hIgG制備的OA-蛋白質(zhì)偶聯(lián)復(fù)合物命名為OA-hIgG，采用BSA制備的OA-蛋白質(zhì)偶聯(lián)復(fù)合物命名為OA-BSA；

或者，將步驟(4)得到的偶聯(lián)物用截留分子量為10000的透析帶在0.01M pH7.4 PBS緩沖液透析24-48h，收集透析袋內(nèi)透析產(chǎn)物，離心去除不溶性雜質(zhì)，所得上清液中加入0.01MpH7.4 PBS，得到OA-蛋白質(zhì)偶聯(lián)復(fù)合物；

其中，OA特異性抗體標(biāo)記量子點熒光探針制備方法如下：將制備的OA-hIgG作為免疫原，通過常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備，進(jìn)一步純化得到OA特異性抗體，然后采用常規(guī)EDC二步法將OA特異性抗體與量子點熒光微球結(jié)合，得到OA特異性抗體標(biāo)記量子點熒光探針；

檢測樣品的方法如下：

C1，準(zhǔn)備檢測樣品：將海產(chǎn)品去殼洗凈淋水后剪碎，取1g剪碎的樣品加1mL提取液勻漿，稱重取五分之一份勻漿后的樣品，加200μL提取液混勻，超聲浸提并離心后，取上清液用0.01M pH7.4 PB緩沖液4倍稀釋，得到檢測樣品；當(dāng)海產(chǎn)品帶殼時，則將海產(chǎn)品洗凈去殼后再剪碎；

C2，上樣分析：將C1中檢測樣品40μL與38μL上樣緩沖液和2μL OA特異性抗體標(biāo)記量子點熒光探針混勻，反應(yīng)10-15min，將反應(yīng)液滴加到腹瀉性貝毒大田軟海綿酸熒光檢測試紙的加樣墊2上，層析20-30min后用藍(lán)光檢測儀觀察分析，根據(jù)檢測帶5和參照帶6熒光強度判斷檢測結(jié)果；檢測帶5為T線，參照帶6為C線；

C3，結(jié)果判斷：當(dāng)C線、T線均出現(xiàn)兩條熒光條帶，且條帶熒光強度接近，則檢測試紙檢測的樣品毒素含量低于5ng/mL；當(dāng)C線出現(xiàn)熒光條帶，T線沒有熒光條帶，反應(yīng)試紙條檢測的樣品毒素含量高于20ng/mL；當(dāng)C線出現(xiàn)熒光條帶，T線出現(xiàn)較弱的熒光條帶，反應(yīng)試紙條檢測的樣品毒素含量在5-20ng/mL之間；當(dāng)C線不顯熒光條帶，無論T線是否有條帶，其結(jié)果均無效。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用腹瀉性貝毒大田軟海綿酸熒光檢測試紙檢測樣品的方法，其特征在于，干燥溫度為10-37℃。