[發(fā)明專利]一種短乳桿菌的轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910328711.4
• 申請日: 2019-04-23
• 公開（公告）號: CN109897863B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李曉敏;劉曉慧;蔡國林;吳殿輝;陸健
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12R1/24
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開了一種短乳桿菌的轉(zhuǎn)化方法，屬于食品微生物技術(shù)領(lǐng)域。由于乳酸菌不同種屬之間菌株的生化特性、分子構(gòu)成和免疫特性均不相同，本發(fā)明在已有乳酸乳球菌以及不含內(nèi)源性質(zhì)粒短乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，將短乳桿菌分別用MRS培養(yǎng)基和含1％甘氨酸的MRS培養(yǎng)基連續(xù)活化兩次，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體達(dá)到較高濃度時(shí)收集并制備感受態(tài)細(xì)胞，以增加感受態(tài)細(xì)胞濃度和活性。電轉(zhuǎn)化外源DNA片段時(shí)電擊條件為2.4KV、3.5ms，增加電轉(zhuǎn)化效率。經(jīng)檢驗(yàn)，外源基因成功轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，解決了野生型短乳桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化的難題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種短乳桿菌的轉(zhuǎn)化方法，屬于食品微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

乳酸菌是一類以同型發(fā)酵或異型發(fā)酵的方式產(chǎn)生乳酸、乙醇、二氧化碳等副產(chǎn)物的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱，在食品工業(yè)如葡萄酒、醬油、香腸等發(fā)酵食品和酒精飲料生產(chǎn)中起著重要的有益作用，如調(diào)節(jié)pH值、保持和改善釀造微生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)糖化和發(fā)酵、促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)及其前驅(qū)物質(zhì)生成等。其中，主要以植物乳桿菌、短乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌等為優(yōu)勢菌種。但乳酸菌發(fā)酵后也會產(chǎn)生一些有毒害作用的代謝產(chǎn)物，如D-乳酸、亞硝酸鹽、生物胺類、吲哚等，這類物質(zhì)如果在畜禽及人體內(nèi)蓄積過多，將會引起不同的疾病甚至癌癥。

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展有助于人類從本質(zhì)上了解乳酸菌的進(jìn)化、功能特點(diǎn)及其與環(huán)境之間的關(guān)系，進(jìn)而使乳酸菌在食品和飼料行業(yè)中得到合理應(yīng)用。盡管迄今已有數(shù)十種乳酸菌的全基因組獲得了測序數(shù)據(jù)，但其中存在許多未知功能的基因，盡管有時(shí)表現(xiàn)出某些酶的活性，但卻不易識別其完整的生理功能。因此，從基因水平來揭示乳酸菌的具體代謝機(jī)制，有助于加速菌株選育和改造，優(yōu)化食品、飼料發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)乳酸菌的安全生產(chǎn)，使工業(yè)乳酸菌的風(fēng)險(xiǎn)降低至零。

由于乳酸菌種屬多，不同種屬之間菌株的生化特性、分子構(gòu)成和免疫特性均不相同，不同宿主菌株需要采用不同的外源基因片段轉(zhuǎn)化方法，才能成功構(gòu)建重組工程菌。目前，僅乳酸乳球菌、植物乳桿菌等少數(shù)種屬具有成熟的轉(zhuǎn)化方法。2016年，楊涓等人以質(zhì)粒pMG36e、Pnz8148、pNZ9530和無內(nèi)源質(zhì)粒的短乳桿菌CGMCC1306為材料，通過對短乳桿菌感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)化過程中各影響因素的考察，建立了一種電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)條件(參考文獻(xiàn)：楊涓,呂常江,羅麥琪,等.一株無內(nèi)源質(zhì)粒短乳桿菌的電轉(zhuǎn)化條件[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2016,35(6):584-590)。然而，經(jīng)發(fā)明人驗(yàn)證，該電轉(zhuǎn)化方法不適用于其他短乳桿菌。因此，提供一種適用范圍較廣且效率較高的短乳桿菌轉(zhuǎn)化方法，對于短乳桿菌的進(jìn)一步應(yīng)用具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種短乳桿菌轉(zhuǎn)化方法，所述方法包括：

(1)活化短乳桿菌；

(2)培養(yǎng)活化后的短乳桿菌至OD₆₀₀為0.8-1.0；

(3)收集菌體，制備感受態(tài)細(xì)胞；

(4)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)加入外源DNA片段后經(jīng)電擊、電轉(zhuǎn)化短乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞，電壓設(shè)置為2.4-2.6KV，電擊時(shí)間為2-4ms；

(5)感受態(tài)細(xì)胞復(fù)蘇，涂布MRS平板，篩選轉(zhuǎn)化子；

(6)提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，并根據(jù)外源DNA片段特異引物進(jìn)行PCR，通過電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)一步驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，短乳桿菌包括短乳桿菌2-34、短乳桿菌ATCC 367或短乳桿菌TMW 1.2112。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)具體為：將短乳桿菌按1-5％接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基活化，35-38℃靜置培養(yǎng)10-14h；按1-5％接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于含1％甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基，35-38℃繼續(xù)活化20-30h。