[發(fā)明專利]一種短乳桿菌的轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910328711.4
• 申請(qǐng)日: 2019-04-23
• 公開（公告）號(hào): CN109897863B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李曉敏;劉曉慧;蔡國林;吳殿輝;陸健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/74
• 分類號(hào): C12N15/74;C12R1/24
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

1.一種短乳桿菌轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述短乳桿菌包括短乳桿菌2-34、短乳桿菌ATCC 367或短乳桿菌TMW 1.2112；所述方法包括：

（1）活化短乳桿菌；

（2）培養(yǎng)活化后的短乳桿菌至OD₆₀₀為0.8-1.0；

（3）收集菌體，用Electroporation Buffer重懸菌體，制備感受態(tài)細(xì)胞；所述Electroporation Buffer為1 mol/L的蔗糖溶液；

（4）感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)加入外源DNA片段后經(jīng)電擊、電轉(zhuǎn)化短乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞，電壓設(shè)置為2.4-2.6 KV，電擊時(shí)間為2-4 ms；

（5）感受態(tài)細(xì)胞復(fù)蘇，涂布MRS平板，篩選轉(zhuǎn)化子。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）具體為：將短乳桿菌按1-5%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基活化，35-38℃靜置培養(yǎng)10-14 h；按1-5%的接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于含1%甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基，35-38℃繼續(xù)活化20-30 h。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）具體為：按1-5%的接種量將活化后的短乳桿菌接種于含1%甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基，35-38℃靜置培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.8-1.0。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3）具體為：將步驟（2）得到的菌體離心，收集菌體，用Washing Buffer洗滌菌體細(xì)胞，用Electroporation Buffer重懸菌體，即得感受態(tài)細(xì)胞。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4）所述電擊方法具體是：取外源質(zhì)粒DNA與感受態(tài)細(xì)胞混勻后于冰上靜置5 min，移入電擊杯，電壓設(shè)置為2.4-2.6 KV，電擊時(shí)間為2-4 ms，使外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，外源質(zhì)粒DNA與感受態(tài)細(xì)胞的比例為400-500：50 ng/μL。

7.如權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，步驟（5）具體包括：電擊結(jié)束后立即向電擊杯中加入MRS液體培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸并轉(zhuǎn)移至新的離心管，于冰上靜置5-10 min，在35-38℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1.5-2 h進(jìn)行復(fù)蘇，離心菌液，棄部分上清，菌體重懸后涂布于MRS固體培養(yǎng)基，35-38℃靜置培養(yǎng)4-5 d。

8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述Washing Buffer為：0.5 mol/L蔗糖，0.5mmol/L MgCl₂，5 mmol/L KH₂PO₄，調(diào)pH為7.4-7.5，115℃高壓滅菌20 min，所述Electroporation Buffer為：0.5 mol/L蔗糖，115℃高壓滅菌20 min。

9.權(quán)利要求1-6,8任一所述的方法在生產(chǎn)短乳桿菌內(nèi)源蛋白或外源蛋白中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求7所述的方法在生產(chǎn)短乳桿菌內(nèi)源蛋白或外源蛋白中的應(yīng)用。