[發(fā)明專利]一種利用馬來酸全細(xì)胞催化合成L-天冬氨酸的菌株與方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910328535.4
• 申請日: 2019-04-23
• 公開（公告）號: CN110004102A
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬江鋒;儲樂樂;方艷;信豐學(xué);董維亮;章文明;陳可泉;姜岷;歐陽平凱
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/90;C12N15/54;C12N15/52;C12N15/60;C12N15/61;C12P13/20;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 徐蓓

本發(fā)明公開了一種利用馬來酸全細(xì)胞催化合成L?天冬氨酸的菌株與方法，所述菌株分類命名為Escherichia coliΔfumABCΔgltAΔargG/pMA，其保藏號為CCTCC NO：M 2019171，構(gòu)建過程包括敲除出發(fā)菌中富馬酸酶編碼基因、檸檬酸合酶編碼基因和精氨基琥珀酸合成酶編碼基因，同時(shí)將天冬氨酸酶編碼基因突變N217K?T233R?V367G和馬來酸順反異構(gòu)酶編碼基因突變G8A?G179A，將兩者克隆到表達(dá)質(zhì)粒上構(gòu)成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至之前敲除了基因的菌株中，得到目的菌株。利用該基因工程菌全細(xì)胞催化合成L?天冬氨酸的方法，實(shí)現(xiàn)了以馬來酸為原料催化合成L?天冬氨酸的路線，降低了生產(chǎn)成本、高效催化，具有經(jīng)濟(jì)性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株利用馬來酸全細(xì)胞催化合成L-天冬氨酸的菌株與方法。

背景技術(shù)

L-天冬氨酸在醫(yī)藥、食品和化工等方面有著廣泛的用途。在醫(yī)藥方面，是氨基酸制劑的主要成分；在化工方面，可以作為制造合成樹脂的原料，大量用于合成環(huán)保材料聚天門冬氨酸；尤其在食品工業(yè)方面，L-天門冬氨酸是一種良好的營養(yǎng)增補(bǔ)劑，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生產(chǎn)原料。具有良好的市場前景。

目前L-天冬氨酸主要以富馬酸為原料，采用生物酶法合成，以馬來酸為原料的研究比較少。而馬來酸相對于富馬酸，價(jià)格更便宜，資源更豐富，也更容易獲得。生物酶法具有反應(yīng)溫和、轉(zhuǎn)化率高、三廢易處理等優(yōu)點(diǎn)，是L-天冬氨酸最佳的生產(chǎn)方式。因此，以馬來酸為底物生物催化生產(chǎn)L-天冬氨酸具有很大意義。本發(fā)明基于此對天冬氨酸酶aspA和馬來酸順反異構(gòu)酶maiA進(jìn)行分子水平優(yōu)化，構(gòu)建了一株利用馬來酸催化合成L-天冬氨酸的基因工程菌，還公布了該基因工程菌全細(xì)胞催化合成L-天冬氨酸的方法，實(shí)現(xiàn)了以馬來酸為原料催化合成L-天冬氨酸的路線，降低了生產(chǎn)成本、高效催化，具有經(jīng)濟(jì)性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要求解決的技術(shù)問題是，提供一株利用馬來酸全細(xì)胞催化合成L-天冬氨酸的菌株，其分類命名為Escherichia coli△fumABC△gltA△argG/pMA，其保藏號為CCTCCNO：M 2019171。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供上述基因工程菌的構(gòu)建方法，敲除保藏號為CCTCC NO：M 2018521出發(fā)菌株富馬酸酶編碼基因fumABC、檸檬酸合酶編碼基因gltA和精氨基琥珀酸合成酶編碼基因argG，同時(shí)將來源大腸桿菌的天冬氨酸酶編碼基因aspA-N217K-T233R-V367G和來源Variibacter gotjawalensis的馬來酸順反異構(gòu)酶A編碼基因maiA-G8A-G179A克隆到表達(dá)質(zhì)粒上構(gòu)成重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至敲除了fumABC、gltA和argG基因的大腸桿菌出發(fā)菌株，得到所述基因工程菌，所述出發(fā)菌株的保藏號為CCTCC NO：M2018521，所述fumA基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述fumB基因序列如SEQ ID NO:2所示，所述fumC基因序列如SEQ ID NO:3所示，所述aspA基因突變N217K-T233R-V367G后序列如SEQ ID NO:4所示，所述maiA基因序列來源Variibacter gotjawalensis突變G8A-G179A后如SEQ ID NO:5所示，所述gltA基因序列如SEQ ID NO:6所示，所述argG基因序列如SEQ IDNO:7所示，基因的敲除采用通用的CRISPR/Cas9技術(shù)。具體構(gòu)建及選育方法如下：

(1)以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列為引物，質(zhì)粒pTarget F為模板，PCR擴(kuò)增得到線性片段1；

(2)以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列為引物，重復(fù)步驟(1)得到線性片段2；以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列為引物，重復(fù)步驟(1)得到線性片段3；以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列為引物，重復(fù)步驟(1)得到線性片段4