[發明專利]一種利用馬來酸全細胞催化合成L-天冬氨酸的菌株與方法

在審

• 申請號: 201910328535.4
• 申請日: 2019-04-23
• 公開（公告）號: CN110004102A
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發明（設計）人: 馬江鋒;儲樂樂;方艷;信豐學;董維亮;章文明;陳可泉;姜岷;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/90;C12N15/54;C12N15/52;C12N15/60;C12N15/61;C12P13/20;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

1.一株利用馬來酸全細胞催化合成L-天冬氨酸的菌株，其分類命名為Escherichiacoli △fumABC△gltA△argG/pMA，其保藏號為CCTCC NO：M 2019171。

2.權利要求1所述菌株的構建方法，其特征在于，敲除保藏號為CCTCC NO：M 2018521的出發菌株富馬酸酶編碼基因fumABC、檸檬酸合酶編碼基因gltA和精氨基琥珀酸合成酶編碼基因argG，同時將天冬氨酸酶編碼基因aspA-N217K-T233R-V367G和馬來酸順反異構酶編碼基因maiA-G8A-G179A克隆到表達質粒上構成重組質粒，并將其轉化至敲除了fumABC、gltA和argG基因的大腸桿菌出發菌株，得到所述基因工程菌，所述fumA基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述fumB基因序列如SEQ ID NO:2所示，所述fumC基因序列如SEQ ID NO:3所示，所述aspA基因突變N217K-T233R-V367G后序列如SEQ ID NO:4所示，所述maiA基因序列來源Variibacter gotjawalensis突變G8A-G179A后如SEQ ID NO:5所示，所述gltA基因序列如SEQ ID NO:6所示，所述argG基因序列如SEQ ID NO:7所示。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列為引物，質粒pTarget F為模板，PCR擴增得到線性片段1；

(2)以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列為引物，重復步驟(1)得到線性片段2；以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列為引物，重復步驟(1)得到線性片段3；以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列為引物，重復步驟(1)得到線性片段4；

(3)將線性片段1用SpeI酶切后進行連接，并將連接后產物轉化到感受態中，涂布大觀霉素的LB平板篩選出陽性重組子；

(4)將陽性重組子接種于添加大觀霉素的LB液培擴繁后進行質粒抽提，獲得pTargetT1-1質粒；

(5)將線性片段2用SpeI酶切后進行連接轉化篩選出陽性重組子進行質粒抽提，獲得pTarget T1-2質粒；將線性片段3用SpeI酶切后進行連接轉化篩選出陽性重組子進行質粒抽提，獲得pTarget T1-3質粒；將線性片段4用SpeI酶切后進行連接轉化篩選出陽性重組子進行質粒抽提，獲得pTarget T1-4質粒；

(6)以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列為引物，大腸桿菌基因組為模板，PCR擴增得到線性片段5；以SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列為引物，大腸桿菌基因組為模板，PCR擴增得到線性片段6；

(7)以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列為引物，片段5和片段6的混合物為模板，重疊PCR擴增得到線性片段7；

(8)將pTarget T1-1質粒用EcoRI線性化后去磷酸化作為載體，與片段7進行吉布森一步克隆，用大觀霉素的LB平板篩選出陽性重組子；

(9)將步驟(8)中的陽性重組子接種于添加大觀霉素的LB液培擴繁后進行質粒抽提，獲得pTarget T2-1質粒；

(10)以SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列為引物重復步驟(6)至步驟(9)獲得pTarget T2-2質粒；以SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列為引物重復步驟(6)至步驟(9)獲得pTarget T2-3質粒；以SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列為引物重復步驟(6)至步驟(9)獲得pTarget T2-4質粒；

(11)將pCas質粒導入保藏號為CCTCC NO：M 2018521的出發菌株中，用卡那霉素的LB平板篩選出陽性重組子；

(12)將步驟(11)中的陽性重組子用阿拉伯糖誘導，制備為感受態；

(13)將pTarget T2-1質粒導入步驟(12)的感受態中，用添加大觀霉素和卡那霉素的LB平板篩選出陽性重組子；

(14)將步驟(13)中的陽性重組子用PCR的方法進行鑒定，篩選出目標菌株，并使用IPTG誘導消除pTarget T2-1質粒，獲得菌株1；

(15)將步驟(14)中的菌株1用阿拉伯糖誘導，制備為感受態；

(16)將pTarget T2-2質粒導入步驟(15)的感受態中，用添加大觀霉素和卡那霉素的LB平板篩選出陽性重組子；

(17)將步驟(16)中的陽性重組子用PCR的方法進行鑒定，篩選出目標菌株，并使用IPTG誘導消除pTarget T2-2質粒，獲得菌株2；

(18)用步驟(15)至步驟(17)的方法分批導入pTarget T2-3質粒、pTarget T2-4質粒進行基因敲除，并使用IPTG誘導消除導入質粒，獲得基因敲除菌株Escherichia coli△fumABC△gltA△argG；

(19)以SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列為引物，pGEMT-maiA質粒為模板，PCR擴增得到線性片段8；以SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列為引物，pGEMT-aspA質粒為模板，PCR擴增得到線性片段9；用DpnI消化后轉化大腸桿菌，獲得pGEMT-maiA-G8A-G179A和pGEMT-aspA-N217K-T233R-V367G；

(20)以SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列為引物，pGEMT-maiA-G8A-G179A為模板，PCR擴增得到線性片段10；以SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列為引物，pGEMT-aspA-N217K-T233R-V367G模板，PCR擴增得到線性片段11；

(21)以SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列為引物，片段10和片段11的混合物為模板，重疊PCR擴增得到線性片段12；

(22)將pTrc99a質粒用EcoRI和HindIII線性化后去磷酸化作為載體，與片段12進行吉布森一步克隆，用含氨芐抗性的LB平板篩選出陽性重組子；

(23)將步驟(22)中的陽性重組子接種于添加大觀霉素的LB液培擴繁后進行質粒抽提，獲得pTrc99A-maiA_mut-aspA_mut質粒；

(24)將步驟(18)中的Escherichia coli△fumABC△gltA△argG制備為感受態；將步驟(23)中的pTrc99A-maiA_mut-aspA_mut質粒轉化至感受態中，用含氨芐抗性的LB平板篩選出陽性重組子，獲得目的基因工程菌株。