[發(fā)明專利]用于檢測POLE基因突變的引物、探針及試劑盒

在審

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• 申請日: 2019-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN110144386A
• 公開（公告）日: 2019-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳釗;莫敏俐;李東霞;劉玉忠;劉陽;張艷
• 申請（專利權(quán)）人: 嘉興雅康博醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種用于檢測POLE基因突變的引物、探針及試劑盒。本發(fā)明所述的引物、探針組合及試劑盒能夠基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)POLE基因突變的準(zhǔn)確檢測，具有檢測速度快、易于判讀結(jié)果、檢測試劑成本低、檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)適用于檢測組織樣本DNA和血漿游離DNA。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種用于POLE基因突變檢測的引物、探針組合及試劑盒。

背景技術(shù)

癌癥發(fā)病率近年來呈逐年上升趨勢，我國每年新增癌癥患者達(dá)350萬人以上。隨著腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)的發(fā)展，癌癥免疫治療已開始進(jìn)入臨床應(yīng)用，選擇合適的患者進(jìn)行免疫治療是其成功的關(guān)鍵。

POLE基因負(fù)責(zé)編碼DNA聚合酶ε的催化亞基，具有以DNA為模板的聚合酶活性，以及核酸外切酶區(qū)的校正活性，負(fù)責(zé)對錯(cuò)配堿基進(jìn)行識(shí)別和修復(fù)。其中，校正活性能夠及時(shí)識(shí)別并切除復(fù)制過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤堿基。

POLE基因發(fā)生突變，常發(fā)生在核酸外切酶區(qū)，該區(qū)域基因突變可導(dǎo)致所編碼的DNA聚合酶ε核酸外切酶區(qū)域的校正功能缺失，在DNA復(fù)制過程中會(huì)導(dǎo)致基因突變率異常增加，異常增加的突變將促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。通過外顯子組測序發(fā)現(xiàn)，POLE突變的體細(xì)胞內(nèi)突變率很高，腫瘤突變負(fù)荷(TMB)非常高。POLE體細(xì)胞突變常發(fā)生在約1～2％的結(jié)直腸癌(CRC)中和7～12％的子宮內(nèi)膜癌(EC)中，并且在腦，胰腺，卵巢，乳房，胃的超突變腫瘤以及子宮癌肉瘤中被檢測到，最常見的突變類型是P286R和V411L，以及S297F、A456P、S459F和F367S，這些突變直接或間接的影響了DNA聚合酶ε核酸外切酶區(qū)域的校正功能。另外，POLE種系突變具有家族遺傳性及致癌性，主要發(fā)生在腸息肉病患者和家族性結(jié)直腸癌中，發(fā)生率約為0.5～2％，突變類型主要是L424V。

研究發(fā)現(xiàn)，POLE基因突變可增強(qiáng)癌癥患者免疫應(yīng)答，可能原因是由于腫瘤細(xì)胞積累了大量的基因變異，導(dǎo)致產(chǎn)生的蛋白更容易被患者的免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)。研究人員在腫瘤免疫染色中發(fā)現(xiàn)POLE突變的腫瘤中存在大量的CD8+陽性的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞標(biāo)志物，PD-1＞90％，并在腫瘤微環(huán)境中鑒定出PD-L1的大量表達(dá)，表明具有POLE突變的腫瘤可能是靶向PD1-PDL1信號(hào)通路藥物的候選者。已有臨床研究報(bào)道攜帶POLE基因突變的癌癥患者接受針對PD-1的免疫治療具有良好的療效。

由此可見，在癌癥患者中檢測POLE基因突變，可以預(yù)測免疫治療的效果，指導(dǎo)醫(yī)生制定合理的治療方案，避免延誤患者的最佳治療時(shí)機(jī)。

針對晚期癌癥患者，當(dāng)無法通過活檢取組織樣本檢測時(shí)，可通過采集全血、分離血漿中游離DNA來實(shí)現(xiàn)基因突變的檢測。由于活檢組織量很少，血漿游離DNA濃度也很低，其中所含的基因突變比例也可能很低，因此不論針對組織樣本還是血漿樣本，均要求基因突變檢測試劑具有高靈敏度和高特異性。

目前針對POLE基因突變檢測方法包括高通量測序(NGS)、數(shù)字PCR(dPCR)。NGS方法檢測靈敏度可達(dá)0.2％，但其檢測步驟繁雜、試劑費(fèi)用昂貴、結(jié)果判讀依賴于生物信息學(xué)分析計(jì)算，檢測周期長；數(shù)字PCR方法檢測靈敏度可達(dá)0.1％，但其檢測步驟較多、試劑費(fèi)用較實(shí)時(shí)熒光PCR昂貴很多、結(jié)果判讀也依賴于專用軟件、對陰性/陽性區(qū)間的劃分主要依賴于針對圖形的主觀判斷。NGS和數(shù)字PCR儀器試劑昂貴，因此對操作人員也有很高要求。

鑒于此，目前亟需能夠快速、簡便、高靈敏度、高特異性、試劑費(fèi)用低、結(jié)果易于判讀的檢測POLE基因突變的試劑。特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)平臺(tái)的、用于同時(shí)檢測POLE基因8種突變型的引物、探針和試劑盒。本發(fā)明包括下列4組16條引物和探針：

第1組

正向引物POLE-1-F1：ACTGCCCCTCAAGTTTAG(SEQ ID No：1)