[發明專利]基于核酸酶偶聯PCR原理富集低豐度DNA突變的檢測技術體系及應用

有效

• 申請號: 201910324580.2
• 申請日: 2019-04-22
• 公開（公告）號: CN109880891B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 馮雁;劉倩;荀冠華;郭翔;李忠磊;崇曰盛
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;王正君

本發明提供了一種基于核酸酶偶聯PCR原理富集低豐度單核苷酸突變型基因的檢測體系。具體地，本發明提供了一種提高目標核酸的相對豐度的方法，包括：(a)提供一核酸樣本，含有目標核酸和非目標核酸，所述目標核酸在核酸樣本中的豐度為F1a；(b)以核酸樣本中的核酸為模板，在擴增?切割反應體系中進行PCR和核酸切割反應，從而獲得擴增?切割反應產物；所述目標核酸在擴增?切割反應產物中的豐度為F1b，F1b/F1a的比值≥10。本發明具有非侵入性、易操作、快速等優勢，靈敏度可以達到0.01％，樣本的DNA量可以低至aM級。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于核酸酶偶聯PCR原理富集低豐度單核苷酸突變型基因(Single nucleotide variant，SNV)的檢測體系。

背景技術

近年來“液體活檢”的概念正在興起，其基本思想為運用血液等體液樣本替代腫瘤組織樣本行病理學、分子生物學的檢測，通過檢測患者體液樣本(主要是血液)中的腫瘤循環DNA來獲取腫瘤基因突變信息已經成為一種趨勢。與目前標準的組織活檢相比，革命性的液體活檢具有下列不可替代的優勢：創傷小、可重復性、均化異質性、實時判斷療效，并隨腫瘤的發展而動態調整治療決策。因此，2015年MIT Technology Review發布的年度十大突破技術(Breakthrough Technologies2015)，ASCO年度進展(Clinical cancer advance2015)中對未來十年的期許，液體活檢均榜上有名。通過檢測ctDNA以追蹤整個病程中腫瘤的特異性基因改變，對腫瘤篩查、診斷、療效監測及預后判斷等具有重要價值，同時可從中探索腫瘤轉移復發及耐藥的分子機制，識別新的靶向治療位點等，因此 ctDNA的檢測已經成為腫瘤液體活檢應用的三大熱門方向之一。

在血液中存在著游離的小片段DNA(cell-free DNA,cfDNA)，它們來自死亡的細胞。通常死亡的細胞會被清除掉，因此cfDNA的含量是非常低的，通常一個健康人的1mL血漿中含25ng cfDNA。而癌癥患者的cfDNA的含量高出正常幾倍，其中一部分是ctDNA(circulating tumor DNA)。ctDNA的相對含量與腫瘤的負荷和對治療的反應是相關的，可用于鑒定驅動基因、指導臨床治療、監測臨床治療效果及癌癥復發、揭示治療抗性以及檢測疾病進展。在有些方面 ctDNA方法的靈敏度甚至高傳統的手段。例如，與傳統的影像學檢測相比，追蹤早期乳腺癌患者術后血液中的腫瘤DNA，可以提前7.9個月發現乳腺癌復發。在肺癌、腸癌中檢測cfDNA的KRAS突變對肺癌也有著重要的診斷價值。ctDNA 在癌癥早期就可以被檢測到。因為cfDNA容易收集，在肺癌中已顯示與組織中的變異高度一致，因此ctDNA的液體活檢越來越受到關注。

循環腫瘤DNA雖然是一種很好的腫瘤組織替代樣本，但是，由于循環腫瘤DNA含量稀少，檢測循環腫瘤DNA需要極靈敏的技術。BEAMing擴增法的應用使得DNA檢測技術靈敏度大大提高。2007年，該技術的開發者美國約翰霍普金斯大學的Bert Vogelstein和KennethKinzler對18名結直腸癌患者的循環腫瘤DNA進行了跟蹤。研究顯示，術后仍能檢測到循環腫瘤DNA的患者，基本上都出現了復發，術后未檢測到循環腫瘤DNA的患者，結直腸癌無復發，顯示了循環腫瘤DNA良好地臨床應用前景。BEAMing技術的靈敏度高，可以達到0.1％～0.01％，是一種比較理想的循環腫瘤DNA檢測技術。但是由于其操作復雜，儀器昂貴，不適用于大規模臨床推廣。