[發明專利]基于核酸酶偶聯PCR原理富集低豐度DNA突變的檢測技術體系及應用有效
| 申請號： | 201910324580.2 | 申請日： | 2019-04-22 |
| 公開（公告）號： | CN109880891B | 公開（公告）日： | 2021-07-30 |
| 發明（設計）人： | 馮雁;劉倩;荀冠華;郭翔;李忠磊;崇曰盛 | 申請（專利權）人： | 上海交通大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6858 | 分類號： | C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 上海一平知識產權代理有限公司 31266 | 代理人： | 徐迅;王正君 |
| 地址： | 200240 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基于 核酸酶 pcr 原理 富集 低豐度 dna 突變 檢測 技術 體系 應用 | ||
1.一種提高目標核酸的相對豐度的方法，其特征在于，包括步驟：
(a) 提供一核酸樣本，所述的核酸樣本含有第一核酸和第二核酸，其中，所述的第一核酸為所述目標核酸，而所述的第二核酸為非目標核酸，
并且，所述目標核酸在所述的核酸樣本中的豐度為F1a；
(b) 對所述核酸樣本中的核酸為模板，在擴增-切割反應體系中進行聚合酶鏈反應(PCR)和核酸切割反應，從而獲得擴增-切割反應產物；
其中，所述的核酸切割反應用于特異性切割非目標核酸，但不切割所述目的核酸；
并且，所述的擴增-切割反應體系含有(i)進行PCR反應所需的試劑和(ii)進行核酸切割反應所需的試劑；
其中，所述目標核酸在所述的擴增-切割反應產物中的豐度為F1b，
其中，當0.1%≤F1a≤0.5%時，F1b/F1a的比值≥100；所述的“進行核酸切割反應所需的試劑”包括：核酸切割工具酶和引導DNA(gDNA)，所述核酸切割工具酶選自以下來自嗜熱微生物的Argonaute蛋白（Ago）：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目標核酸和非目標核酸僅相差一個堿基。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目標核酸為含突變的核苷酸序列。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸切割工具酶選自以下來自嗜熱微生物的Argonaute蛋白（Ago）：
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引導DNA與目標核酸，即第一核酸的靶定區域的核酸序列形成第一互補結合區；并且所述的gDNA還與非目標核酸，即第二核酸的靶定區域的核酸序列形成第二互補結合區。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸切割工具酶和gDNAs的比例為1：2～1：20。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：
(c) 對所述擴增-切割反應產物進行檢測，從而測定所述目標核酸的存在與否和/或數量。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一核酸包括n種不同的核酸序列，其中n為≥1的正整數。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，進行C個“高溫變性-延伸”循環，其中C為≥5。
10.一種擴增-切割反應體系，其特征在于，所述反應體系用于對一核酸樣本同時進行聚合酶鏈反應(PCR)和核酸切割反應，從而獲得擴增-切割反應產物；
其中，所述的核酸樣本含有第一核酸和第二核酸，其中，所述的第一核酸為所述目標核酸，所述的目標核酸為含突變的核苷酸序列，而所述的第二核酸為非目標核酸，所述的非目標核酸為野生型核苷酸序列、高豐度的核苷酸序列、或其組合；
所述的核酸切割反應用于特異性切割非目標核酸，但不切割所述目的核酸；
所述的擴增-切割反應體系含有(i)進行PCR反應所需的試劑；(ii)進行核酸切割反應所需的試劑；和(iii) 核酸樣本，所述的核酸樣本含有第一核酸和第二核酸，其中所述的第一核酸為所述目標核酸，所述的目標核酸為含突變的核苷酸序列，所述的第二核酸為非目標核酸，所述的非目標核酸為野生型核苷酸序列、高豐度的核苷酸序列、或其組合；所述的“進行核酸切割反應所需的試劑”包括：核酸切割工具酶和引導DNA(gDNA)，所述核酸切割工具酶選自以下來自嗜熱微生物的Argonaute蛋白（Ago）：
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