[發(fā)明專利]一種糞便脫落細(xì)胞及其核酸保存試劑及其制備和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910321000.4
• 申請日: 2019-04-21
• 公開（公告）號: CN110029102A
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鞠巍;沈歡;徐根明;潘藝;趙謙
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南大地同年生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 長沙睿翔專利代理事務(wù)所(普通合伙) 43237
• 代理人: 周松華;孫建霞

本發(fā)明屬于糞便檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種糞便脫落細(xì)胞及其核酸保存試劑及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明的保存液，能夠在常溫條件下，長時間地有效抑制糞便樣本中細(xì)菌的增長，防止核酸的降解，并且能夠溫和釋放糞便中的脫落細(xì)胞核酸而不大量地釋放細(xì)菌核酸，離心后獲得的上清液可以直接用于DNA提取、純化或核酸檢測，方便和后續(xù)的操作銜接，并且對后續(xù)的檢測無影響，使用方便。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于糞便檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種糞便脫落細(xì)胞及其核酸保存試劑及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

相對于血液中的癌癥指標(biāo)，某些癌前病變信號更早在腸道脫落細(xì)胞中出現(xiàn)，而且特異性高，并且運用糞便進(jìn)行檢測無創(chuàng)無痛，采樣方便，所以用糞便樣本進(jìn)行某些疾病檢測或癌癥早篩越來越多。糞便樣本，其成分十分復(fù)雜，含有大量的食物殘渣、腐殖酸、色素、各種核酸降解酶和微生物等，而正常的人糞便中脫落的細(xì)胞及其核酸極少，所以，糞便樣本的保存，特別是其中極少的脫落細(xì)胞及其核酸保存成為運用糞便樣本脫落細(xì)胞檢測的關(guān)鍵。

現(xiàn)有的糞便樣本保存和運輸，很多是在-20℃及以下保存，干冰運輸，如果保存或運輸過程中溫度出現(xiàn)變化，特別是室外氣溫較高時，很容易導(dǎo)致其中的核酸降解或微生物增殖，這樣限制了糞便樣本檢測的運用。目前，也出現(xiàn)了不少可以常溫保存糞便樣本的保存試劑，但這些保存試劑，基本只能保證抑菌和抑制核酸降解，后續(xù)提取核酸一般是提取保存液中的沉淀或固液混合物中的核酸，而糞便樣本中的雜質(zhì)和微生物基本都在沉淀和固體中，所以提取的核酸中含有大量的微生物核酸和雜質(zhì)，宿主核酸含量非常低，必然影響后續(xù)的檢測和處理，所以不大適用于檢測糞便樣本中的宿主脫落細(xì)胞核酸的場景。

現(xiàn)有技術(shù)中公開了較多的糞便樣本保存液的技術(shù)方案，如CN108893523A《一種糞便樣品常溫保存液》公開了如何釋放保存糞便樣本里的腸道菌群的技術(shù)方案，保存液中使用了硫氰酸胍等強(qiáng)效裂解成分，才能釋放有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的腸道菌群的核酸。但因為糞便里絕大部分是腸道微生物，如果讓腸道菌群完全釋放核酸，宿主細(xì)胞核酸將被完全掩蓋，導(dǎo)致后續(xù)無法檢測宿主細(xì)胞核酸。

CN106596211A《糞便樣本保存液及其制備方法和應(yīng)用》公開了如何保存糞便樣本里腸道菌群微生物和脫落細(xì)胞，使其維持細(xì)胞形態(tài)，并且保存已經(jīng)釋放的所有核酸，而不是主動釋放糞便樣本里的核酸的技術(shù)方案，因此在保存液中用到固定劑和抗凝劑等成分，維持細(xì)胞形態(tài)，而不含任何裂解成分。

因此，開發(fā)一種釋放并保存糞便樣本里的宿主脫落細(xì)胞及其核酸，并且抑制腸道菌群的糞便保存液是未來的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種糞便脫落細(xì)胞及其核酸保存試劑及其制備和應(yīng)用，目的是實現(xiàn)在常溫和氣溫較高的極端環(huán)境下，長時間抑制糞便樣本中細(xì)菌的增殖和核酸降解，還可以溫和地釋放糞便樣本中的脫落細(xì)胞核酸而不大量地釋放微生物核酸，離心后得到的糞便上清，可以直接用于核酸提取或純化后直接檢測，因為后續(xù)提取不用處理糞便沉淀和固體，所以相對于其他保存液，獲得的DNA中，獲得的宿主核酸含量高，且核酸質(zhì)量較好，用市面上常用的核酸提取試劑盒和處理方法即可提取，不影響后續(xù)檢測，向后兼容性非常好，非常適用于需要檢測糞便樣本中宿主脫落細(xì)胞核酸的場景。

本發(fā)明的糞便脫落細(xì)胞及其核酸保存試劑，包括緩沖試劑、金屬離子螯合劑、抑菌劑、離子型去垢劑和表面活性劑；其中所述的緩沖試劑是pH 7～10的50mM～1M Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液；所述的金屬離子螯合劑是1mM～100mM乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性鹽中的至少一種；所述的抑菌劑是二醇類、苯甲醇、苯乙醇、ProClin^TM300和NaCl中的至少一種；所述的離子型去垢劑選自濃度0.1％～10％的十二烷基硫酸鈉、十二烷基璜酸鈉、十二烷基硫酸鋰、癸基硫酸鈉、辛基硫酸鈉、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯鈉、尿素等中的至少一種；所述的表面活性劑為非離子型去污劑，包括濃度0.5％～10％Brij-35、Tween-20、Tween-80、NP40和Triton-100中的至少一種。