[發明專利]一種外源基因的檢測方法與試劑盒

在審

• 申請號: 201910320127.4
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110172504A
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發明（設計）人: 彭海
• 申請（專利權）人: 武漢明了生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 南京中高專利代理有限公司 32333
• 代理人: 祝進

1.一種外源基因的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括：

確定待測樣品中需要檢測的外源基因和所述待測樣品中的內源標準基因；

根據所述外源基因的人工序列、所述外源基因的邊界序列或所述內源標準基因的序列制備雜交探針；

提取并純化所述待測樣品的基因組DNA和質控樣品的基因組DNA；

將所述待測樣品的基因組DNA和所述質控樣品的基因組DNA均片段化，獲得待測樣品DNA片段和質控樣品DNA片段；

在所述待測樣品DNA片段和所述質控樣品DNA片段上分別連接上接頭序列，獲得帶有所述接頭序列的所述待測樣品DNA片段和帶有所述接頭序列的質控樣品DNA片段；

采用聚合酶鏈式反應擴增所述帶有接頭序列的所述待測樣品DNA片段和所述帶有接頭序列的質控樣品DNA片段，獲得第一擴增產物；

利用所述雜交探針富集所述第一擴增產物，獲得富集產物；

采用PCR擴增所述富集產物，獲得第二擴增產物；

純化所述第二擴增產物，獲得測序文庫；

對所述測序文庫進行高通量測序，獲得高通量測序數據；

對所述高通量測序數據進行質量控制，獲得合格的測序數據；

根據所述合格的測序數據獲得模板片段和所述外源基因的特征片段；

利用所述模板片段和所述特征片段對所述待測樣品中的所述外源基因進行檢測，判定所述外源基因是否存在于所述待測樣品中。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述需要檢測的外源基因為至少一種。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述人工序列為人為對自然界存在的所述外源基因改造后的序列。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述接頭序列包括樣品條形碼序列和隨機條形碼序列中的至少一種；

在同一實驗室，所述檢測方法小于或等于一天時，所述樣品條形碼不重復使用。

5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，獲得所述模板片段的方法包括：

利用具有相同的所述隨機條形碼，在參考基因組上有具有相同比對起點位置和相同的比對終點位置的一組所述測序片段的序列計算獲得所述模板片段；所述一組測序片段中比例超過R1的堿基序列為所述模板片段的所述堿基序列；若無比例超過R1的所述堿基序列，則將所述模板片段的中所述堿基序列計為任意堿基，所述任意堿基為A、T、C或G。

6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述特征片段包括所述外源基因的序列但在自然界中不存在的所述模板片段；

所述特征片段包括以下兩種序列中的至少一種：

a)所述人工序列；

b)所述外源基因的序列與除所述外源基因在起源物種中的邊界序列之外的序列的連接序列。

7.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述質量控制的方法包括：

統計所述待測樣品中所述內源標準基因的模板片段的數目TRF；統計在所述待測樣品的內源標準基因的模板片段中，僅包含1個所述測序片段的模板片段的比例，記作TRFs；

當TRF>N2時，判定所述測序數據為合格，N2為判定所述測序數據合格的閾值。

8.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述待測樣品中的外源基因進行檢測的方法包括：

計算所述待測樣品中的外源基因的特征片段的數目TEF；

當TEF>N3時，判定所述待測樣品中存在所述外源基因；

當TEF≤N3時，判定所述待測樣品中不存在所述外源基因。

9.一種用于如權利要求1～8任一項所述的檢測方法的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：所述雜交探針和所述接頭序列，

所述雜交探針根據所述外源基因的人工序列、所述外源基因的邊界序列或所述內源標準基因的序列制備；

所述接頭序列包括：樣品條形碼序列和隨機條形碼序列中的至少一種。