[發(fā)明專利]利用選擇性過濾柱對法醫(yī)檢樣中DNA進(jìn)行純化濃縮的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910319898.1
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110129313A
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張丹;熊槐;梁龍杰
• 申請（專利權(quán)）人: 山東森芃生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京和信華成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11390
• 代理人: 胡劍輝

本發(fā)明公開了一種利用選擇性過濾柱對法醫(yī)檢樣中DNA進(jìn)行純化濃縮的方法，具體如下：將消化裂解后的細(xì)胞液加入選擇性過濾柱的內(nèi)管中，同時將選擇性過濾柱在離心機(jī)中離心；向選擇性過濾柱內(nèi)加入5?100微升水，震蕩30s后，將選擇性過濾柱內(nèi)的水溶液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管內(nèi)，此時離心管的溶液即為純化濃縮后的溶液。本發(fā)明利用裂解液將檢樣中殘留的人源細(xì)胞進(jìn)行裂解消化后，DNA完全游離于溶液中，通過離心管將檢樣中的固體顆粒離心除去，再通過選擇性過濾柱的底部的超濾膜，在高速離心情況下，超濾膜僅對小分子物質(zhì)具有透過性，對生物大分子物質(zhì)DNA無透過性，進(jìn)而能夠?qū)崿F(xiàn)大分子物質(zhì)DNA的純化濃縮。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬法醫(yī)物證鑒定領(lǐng)域，涉及一種利用選擇性過濾柱對法醫(yī)檢樣中DNA進(jìn)行純化濃縮的方法。

背景技術(shù)

法醫(yī)DNA分型是法醫(yī)物證鑒定的重要技術(shù)手段之一，常見法醫(yī)DNA分型技術(shù)包括限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)(RFLPs)、短串聯(lián)重復(fù)序列分析技術(shù)(STR)、單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)(SNP)、DNA甲基化分析技術(shù)等等。無論是哪一種DNA分型技術(shù)，都離不開核酸提取純化技術(shù)，只有從法醫(yī)檢樣中提取到高質(zhì)量的DNA，下游的DNA分型技術(shù)才能有得到有效地分型數(shù)據(jù)。

DNA提取，首先，需要將細(xì)胞進(jìn)行裂解，使得細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)釋放出來；其次，需要消化分解染色質(zhì)中的蛋白質(zhì)，使得DNA完全游離出來；再次，需要將溶液中存在的細(xì)胞碎片、無機(jī)鹽等雜質(zhì)去除，對DNA進(jìn)行純化。目前，商品化的DNA提取試劑盒中，細(xì)胞裂解消化一般利用表面活性劑和蛋白酶K來完成，DNA純化一般利用硅膠膜、磁珠、硅珠在特殊溶液條件下對DNA的可逆吸附來完成，這些商品化試劑盒的缺點是需要反復(fù)漂洗硅膠膜、磁珠、硅珠來去除細(xì)胞碎片、無機(jī)鹽等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用選擇性過濾柱對法醫(yī)檢樣中DNA進(jìn)行純化濃縮的方法，利用裂解液將檢樣中殘留的人源細(xì)胞進(jìn)行裂解消化，待細(xì)胞膜、核膜、蛋白質(zhì)等組分被消化后，DNA完全游離于溶液中，通過離心管將檢樣中的固體顆粒離心除去，濾液中僅包含DNA一種生物大分子及一些小分子，再利用選擇性過濾柱截留生物大分子DNA，濾去小分子物質(zhì)，使得濾液中的小分子DNA得到純化濃縮，選擇性過濾柱的底部裝配了超濾膜，在高速離心情況下，超濾膜僅對小分子物質(zhì)具有透過性，對生物大分子物質(zhì)DNA無透過性，進(jìn)而能夠?qū)崿F(xiàn)大分子物質(zhì)DNA的純化濃縮。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種利用選擇性過濾柱對法醫(yī)檢樣中DNA進(jìn)行純化濃縮的方法，具體如下：

第一步，將消化裂解后的細(xì)胞液加入選擇性過濾柱的內(nèi)管中，同時將選擇性過濾柱在3000-14000r/min的離心機(jī)中離心1-10min，將小分子物質(zhì)過濾除去；

第二步，向選擇性過濾柱內(nèi)加入5-100微升水，震蕩30s后，將選擇性過濾柱內(nèi)的水溶液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管內(nèi)，此時離心管的溶液即為純化濃縮后的溶液；

其中選擇性過濾柱包括外管和套設(shè)在外管內(nèi)部的內(nèi)管，內(nèi)管的管底開有出液口，出液口處一體連接固定有出液管，同時內(nèi)管的側(cè)壁內(nèi)表面位于出液口的上方安裝有支撐板，支撐板的表面開有若干濾液孔，同時支撐板的表面從下到上依次設(shè)有超濾膜和密封壓圈，密封壓圈壓緊在超濾膜的表面。

進(jìn)一步地，細(xì)胞液的具體消化裂解過程如下：①對法醫(yī)檢樣進(jìn)行取材，加入細(xì)胞裂解消化液，在50-80℃下裂解消化15min-12h；②將裂解消化后的細(xì)胞液放入離心管中，在3000-14000r/min的離心機(jī)中離心1-10min，然后取離心管中上清溶液至選擇性過濾柱內(nèi)。

進(jìn)一步地，所述超濾膜為孔徑范圍為1nm-100nm的微孔過濾膜。

進(jìn)一步地，超濾膜的材質(zhì)為纖維素、纖維素的衍生物、聚偏氟乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺交鏈的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚合物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚砜酰胺、磺化聚砜中的一種，或其它能制成孔徑范圍為1nm-20nm超濾膜的材質(zhì)。