[發明專利]一種半胱氨酸單細胞生物傳感器的構建及應用

在審

• 申請號: 201910318357.7
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110283764A
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: 劉君;劉川;徐寧
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12Q1/02;C12N15/01;G01N21/64;C12R1/19
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本發明公開了一種檢測L?半胱氨酸生物傳感器的制備方法，以及在該生物傳感器在檢測大腸桿菌L?半胱氨酸產量中的應用。該生物傳感器主要元件包括，來源于菠蘿泛菌中轉錄調控基因CcdR編碼基因及其啟動子區和終止子區、來源于菠蘿泛菌中基因ccdA的啟動子區、綠色熒光蛋白編碼基因eGFP和質粒骨架pTrc?Mob。該生物傳感器可在0～32mmol L^?1 L?半胱氨酸濃度下表現良好的線性關系，在0.01～8mmol L^?1 L?半胱氨酸濃度下，熒光強度值與半胱氨酸濃度線性關系最高。與高通量篩選體系相結合，利用該生物傳感器對大腸桿菌L?半胱氨酸產量進行實時檢測，并能夠篩選出L?半胱氨酸高產突變體，以及L?半胱氨酸生物合成途徑關鍵酶的突變體。本發明可實現對L?半胱氨酸的特異性定量實時檢測，且靈敏度高。

技術領域

本發明屬于生物傳感器技術領域，涉及一種L-半胱氨酸生物傳感器的構建及其應用。

背景技術

L-半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸，廣泛應用于食品，醫藥以及化妝品行業。因含有還原性極強的巰基，L-半胱氨酸可以將其作為一種天然的還原劑，用于斷裂蛋白質當中的二硫鍵。比如，以其衍生物乙酰L-半胱氨酸為主要成分的祛痰液可以斷裂痰當中的二硫鍵以降低痰的粘性；又如，L-半胱氨酸為主要成分的燙發液可以斷裂頭發當中的二硫鍵，所以大量應用于美發行業當中；再如，L-半胱氨酸及其衍生物谷胱甘肽可以斷裂酪氨酸酶中的二硫鍵以使其失活，減少酪氨酸酶產生的黑色素，因而被應用于美容美白產品。以發酵方法生產L-半胱氨酸由于其環境與成本方面的優勢被研究者們期望代替傳統的水解生產方法。在實驗室中，大腸桿菌、菠蘿泛菌、谷氨酸棒狀桿菌等都被進行代謝改造，作為發酵菌株以生產L-半胱氨酸，其發酵產量可以達到1500mg/L。

已報到的L-半胱氨酸檢測方法包括化學檢測法、生長互補檢測法、高效液相色譜法等，但這些方法靈敏度低、專一性不強并無法用于高通量篩選。在發酵生產中，由于培養基成分復雜，容易對L-半胱氨酸的檢測產生干擾。目前還未有L-半胱氨酸高產菌株的高通量篩選方法的相關報道，其主要原因是因為已知的檢測方法不能與以流式細胞分選為代表的高通量篩選方法相偶聯。因此，急需一種實時、準確、靈敏的L-半胱氨酸檢測方法。

本發明基于轉錄調控因子CcdR，將L-半胱氨酸濃度與熒光強度相偶聯，構建了可檢測L-半胱氨酸濃度的生物傳感器，可實現對L-半胱氨酸的特異性定量檢測。

發明內容

針對目前缺乏快速、靈敏且高特異性檢測L-半胱氨酸的方法的問題，本發明提供了一種基于轉錄調控因子CcdR的單細胞L-半胱氨酸生物傳感器及其構建方法，該生物傳感器可以將L-半胱氨酸濃度轉化為熒光強度信號，具有很高的靈敏度。

所述L-半胱氨酸單細胞生物傳感器由來源菠蘿泛菌中轉錄調控因子CcdR編碼基因及其啟動子區和終止子區、來源菠蘿泛菌中基因ccdA的啟動子區、綠色熒光蛋白編碼基因eGFP和質粒骨架pTRCmob質粒組成。通過基因融合的方法將各組成區進行組裝，獲得質粒pCcdRAe。

所述的單細胞生物傳感器檢測L-半胱氨酸濃度包括以下步驟：

(1)在37℃的溫度下對含有質粒pCcdRAe的大腸桿菌進行預培養12小時以上直至進入穩定期；

(2)將預培養的大腸桿菌以1:50的接種量接種到新鮮的培養基中；

(3)菌液OD₆₀₀至0.5時加入L-半胱氨酸溶液，2小時后測定熒光強度。

本發明的另一個目的是提供一種能與高通量篩選體系相結合的L-半胱氨酸檢測手段，并且證明該方法可以應用于L-半胱氨酸高產菌株和L-半胱氨酸生物合成相關酶的篩選當中，以獲得L-半胱氨酸產量菌株。

所述L-半胱氨酸單細胞生物傳感器高通量篩選L-半胱氨酸高產菌株包括以下步驟：