[發明專利]一種半胱氨酸單細胞生物傳感器的構建及應用

在審

• 申請號: 201910318357.7
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110283764A
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: 劉君;劉川;徐寧
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12Q1/02;C12N15/01;G01N21/64;C12R1/19
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1.一種L-半胱氨酸單細胞生物傳感器，其特征在于：包括轉錄調控因子CcdR編碼基因及其啟動子區和終止子區、基因ccdA啟動子區、綠色熒光蛋白編碼基因eGFP和質粒骨架。

2.根據權利要求1所述的L-半胱氨酸單細胞生物傳感器，其特征在于：所述轉錄調控因子CcdR編碼基因及其啟動子區和終止子區來源于菠蘿泛菌；基因ccdA的啟動子區來源于菠蘿泛菌；綠色熒光蛋白編碼基因eGFP序列為NCBI數據庫標準序列。

3.根據權利要求1～3所述的L-半胱氨酸單細胞生物傳感器質粒骨架，其特征在于：能在宿主菌中表達目的基因，所述宿主菌為大腸桿菌或棒桿菌，優選骨架為pTRCmob表達質粒。

4.一種L-半胱氨酸單細胞生物傳感器的構建方法，包括以下步驟：將CcdR編碼基因及其啟動子區和終止子區核苷酸片段、ccdA的啟動子區核苷酸片段和綠色熒光蛋白編碼基因eGFP整合至pTRCmob表達質粒中，獲得響應L-半胱氨酸的表達質粒pCcdRAe。

5.一種L-半胱氨酸單細胞生物傳感器在L-半胱氨酸產物檢測中的應用，包括以下步驟：

1)將含有質粒pCcdRAe的大腸桿菌于LB液體培養基中培養至穩定期；

2)以1:50(v/v)的接種量轉接種到新鮮的LB培養基中，培養至OD₆₀₀為0.5～0.8時加入終濃度為0～50mmol/L L-半胱氨酸溶液，2小時后測定熒光強度，其中激發波長為488nm，發射波長為510nm。

6.一種L-半胱氨酸單細胞生物傳感器在篩選L-半胱氨酸高產菌株的應用，包括以下步驟：

1)將含有質粒pCcdRAe的大腸桿菌于LB液體培養基中過夜培養；

2)使用生理鹽水洗滌菌體并重懸至OD₆₀₀＝1～2，取10μL涂布在1mm貼片上；使用常壓室溫等離子體誘變儀(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)照射5～20s進行菌體誘變；

3)將誘變后的菌體轉接至LB液體培養基中過夜培養，使用流式細胞儀篩選熒光信號明顯提升的候選細胞；

4)篩選的單菌落接種至LB培養基中振蕩培養10～20h，使用酶標儀或熒光分光光度計測定其熒光強度，并用液相色譜儀檢測L-半胱氨酸的濃度，篩選得到L-半胱氨酸高產菌株。

7.一種L-半胱氨酸單細胞生物傳感器在高通量篩選L-半胱氨酸生物合成相關基因突變體中的應用，包括以下步驟：

1)使用易錯PCR對待篩選基因進行隨機突變；

2)構建突變體質粒文庫并轉化至含有質粒pCcdRAe的大腸桿菌中獲得突變體庫；

3)突變體接種于含有培養基的96孔板中，培養10～20h，使用酶標儀測定菌體熒光強度；

4)熒光值高于野生型2倍以上的突變體，進行L-半胱氨酸濃度和酶催化活性檢測。