[發明專利]一種基于表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒的藥物篩選系統及其應用

有效

• 申請號: 201910318209.5
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110195093B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 步志高;華榮虹
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心）
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12N7/01
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發明公開了一種基于表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒的藥物篩選系統及其應用。本發明的一種藥物篩選系統由表達綠色熒光蛋白(GFP)的重組寨卡病毒(報告型寨卡病毒)以及表達DC?SIGNR的BHK?21細胞系組成。本發明的報告型寨卡病毒表達綠色熒光蛋白，熒光號強，且在胞漿內均勻著色，易于觀察，易于高通量篩選分析。穩定表達DC?SIGNR的BHK?21細胞系提高了對報告型寨卡病毒感染的敏感性，提高了病毒復制效率，減少了病毒復制壓力，也提高了重組病毒的穩定性。通過本發明的藥物篩選系統可在活細胞狀態下對藥物作用前后的病毒復制情況進行直接觀察與分析，不需要對細胞進行固定與免疫染色，使整個操作流程更簡便快捷，且減少了活病毒操作步驟，提高了整個操作流程的安全性。

技術領域

本發明涉及一種抗病毒藥物的篩選系統及其應用，特別涉及一種基于表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒的藥物篩選系統及其應用。本發明屬于生物技術領域。

背景技術

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一種主要經蚊媒傳播的人獸共患病病原，其與登革熱病毒(Dengue virus,DENV)，西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)，日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和黃熱病毒(Yellow Fever virus,YFV)等同屬黃病毒科黃病毒屬成員。1947年，Dick等研究人員在烏干達寨卡森林中的恒河猴體內將其分離出來。ZIKV感染宿主后能引起寨卡熱，大多數感染者并沒有明顯癥狀或者癥狀較為輕微，包括結膜炎、皮疹、發熱、關節和肌肉疼痛等癥狀，病程約2-7天。但若在妊娠期間發生ZIKV感染，則可能使新生兒患有小頭癥和其他先天性畸形，同時還可能造成妊娠者發生早產和流產等嚴重癥狀。研究顯示，世界上約有86個國家或地區存在ZIKV，這表明ZIKV在全球范圍內呈蔓延趨勢。日前沒有批準應用的疫苗與抗病毒藥物。為了更有效地防控該病，需要采取多種先進技術手段進行疫苗研究與藥物篩選。運用反向遺傳操作系統構建報告型病毒來加快該病毒病的疫苗研究，報告型病毒還為藥物篩選提供重要技術平臺，是病毒學研究的有效先進手段。但是由于基因組的不穩定性以及攜帶外源基因的重組病毒的不穩定性，在黃病毒中，構建穩定的報告型病毒一直是一個難題與挑戰。

ZIKV病毒粒子呈球形，其直徑約40～70nm，病毒粒子外有一層來自于宿主衍生的脂質囊膜包裹，基因組為不分節段的單股正鏈RNA，長度約11kb，其編碼基因順序為5’-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’。RNA翻譯為一個多聚蛋白，然后通過蛋白酶裂解為結構蛋白衣殼蛋白(capsid,C)、前體膜蛋白(precursor membrane,prM)、囊膜蛋白(envelope,E)以及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5七種非結構蛋白。其中C蛋白結合ZIKV基因組RNA形成核衣殼核心，prM蛋白和E蛋白則形成病毒表面蛋白，而在宿主細胞內，非結構蛋白則參與病毒復制及多聚蛋白剪切加工等過程。目前，依據分子生物學和生物信息學可將其分為亞洲型和非洲型兩種亞型。構建穩定的病毒基因組克隆存在困難是由于在病毒基因組的E蛋白基因與NS1蛋白基因中存在對宿主菌具有毒性的編碼序列。且研究顯示，通過反向遺傳操作技術構建表達熒光素酶基因或熒光蛋白基因的報告型寨卡病毒均存在復制能力下降，外源基因表達不穩定，在傳代后外源基因迅速丟失的情況。

本發明通過細胞內重組的方法，構建了表達綠色熒光蛋白(GFP)的重組寨卡病毒ZIKV-GFP。而且構建了一株表達DC-SIGNR的細胞系。該細胞系促進了報告型寨卡病毒ZIKV-GFP的復制，降低了重組病毒的遺傳穩定壓力，提高了重組報告型病毒的穩定性。該重組病毒與穩定表達細胞系組成了一個方便的寨卡病毒藥物篩選系統，可以用于抗寨卡病毒的藥物篩選，還可以用于寨卡病毒的中和抗體檢測，可以用于寨卡病毒疫苗效果評價。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于抗寨卡病毒藥物篩選的系統，以克服報告型寨卡病毒存在的復制能力低，不穩定等缺陷。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：