[發明專利]一種基于表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒的藥物篩選系統及其應用

有效

• 申請號: 201910318209.5
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110195093B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 步志高;華榮虹
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心）
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12N7/01
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

1.一種基于表達綠色熒光蛋白(GFP)的重組寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)的藥物篩選系統，其特征在于，所述的藥物篩選系統由表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒以及表達DC-SIGNR的BHK-21細胞系組成；

其中，所述的表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒是通過以下方法制備得到的：

1)根據寨卡病毒基因序列，通過分段基因合成技術合成除結構蛋白基因外的其它基因組序列以及插入缺失的結構蛋白基因位置的GFP報告基因序列基因，通過多克隆酶切位點連入哺乳動物表達載體，獲得復制子重組質粒，該復制子重組質粒的開放閱讀框為“CMV啟動子-酶切位點-5′UTR-編碼C蛋白N端20個氨基酸的核苷酸序列-GFP-FMDV2A-編碼E蛋白C端22個氨基酸的核苷酸序列-NS1～5-3′UTR-HDVr-酶切位點”；

2)根據寨卡病毒基因序列，通過基因合成技術分別合成結構蛋白基因序列以及GFP序列，各元件的連接順序為5′UTR–編碼ZIKV C蛋白C端38個氨基酸的核苷酸序列-GFP-FMDV2A-C-prM-E-NS1基因1-134位核苷酸序列，通過多克隆酶切位點將該片段克隆到哺乳動物表達載體上，得到含有ZIKV結構基因以及綠色熒光蛋白的質粒；

3)報告型ZIKV的拯救

以步驟2)的得到的質粒為模板，進行PCR擴增，擴增獲得含有CMV啟動子以及5′UTR–編碼ZIKV C蛋白C端38個氨基酸的核苷酸序列-GFP-FMDV2A-C-prM-E-NS1基因1-134位核苷酸序列的PCR產物，PCR產物用于報告型病毒的拯救；

報告型ZIKV的拯救：HEK-293T細胞于24孔板內用10％v/v FBS DMEM培養基培養至密度為70％-90％，利用TransIT-293Transfection Reagent轉染試劑將得到的PCR產物和線性化的復制子重組質粒分別進行轉染，轉染72h后，收獲細胞及上清于-70℃保存，得到表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒；

其中，所述的寨卡病毒基因序列是2015年巴西流行的ZIKV株的基因序列，Genbank登錄號為：KX280026；

其中，所述的表達DC-SIGNR的BHK-21細胞系是通過以下方法構建得到的：

1)構建含有DC-SIGNR的表達質粒：

DC-SIGNR的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，將合成后的DC-SIGNR序列克隆到pCAGneo載體中，得到含有DC-SIGNR的表達質粒；

2)將已制備的含有DC-SIGNR的表達質粒進行線性化，經膠回收后，對BHK-21細胞進行轉染；

3)篩選獲得穩定表達DC-SIGNR的BHK-21細胞系。

2.如權利要求1所述的藥物篩選系統，其特征在于，所述的表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒制備的步驟1)中是通過多克隆酶切位點Sac I和Not I連入哺乳動物表達載體pCI-neo，獲得復制子重組質粒，該復制子重組質粒開放閱讀框依次為CMV啟動子-Sac I-5′UTR-編碼C蛋白N端20個氨基酸的核苷酸序列-GFP-FMDV2A-編碼E蛋白C端22個氨基酸的核苷酸序列-NS1～5-3′UTR-HDVr-Not I。

3.如權利要求1所述的藥物篩選系統，其特征在于，所述的表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒制備的步驟2)中是通過多克隆酶切位點XhoI與NotI將5′UTR–編碼ZIKV C蛋白C端38個氨基酸的核苷酸序列-GFP-FMDV2A-C-prM-E-NS1基因1-134位核苷酸序列克隆到pCI-neo載體上。

4.如權利要求1所述的藥物篩選系統，其特征在于，所述的表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒制備的步驟3)以步驟2)的得到的質粒為模板，用引物P1：5’-GGCCTTTTGCTCACATGGCTCGACAG-3’與P2：5‘GACTGCTGCTGCCAATCTACGGGGG-3’進行PCR擴增，PCR產物用于報告型病毒的拯救。

5.權利要求1-4任一項所述的藥物篩選系統在篩選抗寨卡病毒藥物中的應用。

6.一種使用權利要求1-4任一項所述的藥物篩選系統篩選抗寨卡病毒藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)藥物處理與病毒感染：將表達DC-SIGNR的BHK-21細胞系以2％v/vFBS 100ul培養基接種于黑色96孔板，待細胞密度達90％時，用50ul含2％v/v FBS的DMEM培養基稀釋過的待測藥物作用1h，1h后加入表達綠色熒光蛋白的重組寨卡病毒感染，于37℃，5％CO₂培養箱中培養48h；

2)高內涵系統統計分析：細胞經藥物處理與病毒感染48h后，用Hoechst染色細胞核，將細胞板置于高內涵細胞篩選系統觀察，采用綠色熒光蛋白熒光通道與細胞核染色熒光通道掃描分析，統計每孔感染陽性細胞數與總細胞數，計算病毒感染率，計算待測藥物對病毒復制的抑制率。