[發明專利]一種辣椒及制品中轉基因成分檢測及應用方法

在審

• 申請號: 201910318174.5
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN109929922A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 羅阿東;王艷;吳山楠;蔡秋
• 申請（專利權）人: 貴州出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心（貴州國際旅行衛生保健中心）
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6806
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 包曉靜

1.一種辣椒及制品中轉基因成分檢測方法，其特征在于，所述辣椒及制品中轉基因成分檢測方法為：

步驟一：樣品前處理：采用洗滌方式，去除樣品中的其他物質；

步驟二：核酸提取：改良CTAB法進行辣椒制品核酸提取；

步驟三：建立檢測方法：針對辣椒轉基因基團設計特異性的熒光PCR引物、探針，建立并優化反應條件，達到最佳反應設置；

探針，其序列為：上游引物TMV1序列CATCCCAATTCGTGTTCTTGTC，下游引物TMV2序列CTTGTTGTGTTTGAAACTGATTTCCT，探針TMV Prober序列FAM-TCAGCGTGGGCCGACCCAAT-TAMRA建立并優化反應條件；

反應體系為：Premix Ex TaqTM(2×)12.5μL、上游引物TMV1(10μM)1μL、下游引物TMV2(10μM)1μL、探針TMV Probe 0.5μL、ROX Reference Dye(50×)0.5μL、DNA模板3μL、滅菌ddH₂O 6.5μL；反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性10s,60℃退火、延伸40s，40個循環。

2.如權利要求1所述的辣椒及制品中轉基因成分檢測方法，其特征在于，所述步驟一中，其他物質為油、鹽、糖、添加劑及其發酵產物一種或兩種及以上。

3.如權利要求1所述的辣椒及制品中轉基因成分檢測方法，其特征在于，所述步驟一中，辣椒制品中DNA提取步驟如下：

(1)取適量樣品與2倍體積的超純水至50mL離心管中，充分混勻，于離心機離心5min，棄上清，重復洗滌3～5次；液體樣品，可使用均質器破壞樣品的穩定性并加以分離、濃縮，取適量樣品與2倍體積的超純水至2mL離心管中，充分混勻，于離心機離心5min棄上清，重復洗滌3～5次；

(2)取樣品約0.3g置于球磨儀研磨，加入700μL提取液TK；TK提取液組成為：4.00gCTAB、16.38g NaCl、2.42g Tris-base和1.50g Na2EDTA，pH＝8.0，攪動，將磨碎液倒入1.5ml的滅菌離心管中，于56℃金屬浴加熱振蕩30min，加入5μL 5mol/L醋酸鉀溶液，混勻，再56℃金屬浴20min；

(3)取出離心管后放置在冰上，加入等體積的氯仿/異戊醇24:1，輕輕來回顛倒，充分混勻；放入4℃高速冷凍離心機中離心15min；

(4)吸取上清液500μL放入另一離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，放入-20℃冰箱中15min；

(5)12000rpm離心5min后，棄上清，加入500μL75％乙醇，輕彈離心管，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中，放置10min，使DNA塊狀物上的不純物溶解；

(6)12000rpm離心5min后棄上清，加入等量75％乙醇再洗10min，12000rpm離心5min后，棄上清液，并將離心管倒立于濾紙之上，自然風干，加入50μLTE溶液，使DNA溶解，置于-20℃冰箱冷凍保存、待用。

4.一種如權利要求1所述的辣椒及制品中轉基因成分檢測的應用方法，其特征在于，所述辣椒及制品中轉基因成分檢測方法的應用方法為：

步驟一：方法驗證：對以上建立的實時熒光PCR檢測方法進行方法驗證，同時對檢測的特異性、準確性、靈敏度進行驗證；

步驟二：通過對收集的樣品進行應用檢測的結果，對市場上的辣椒及制品進行轉基因檢測應用。