[發明專利]一種干細胞體外誘導培育心肌細胞的方法

有效

• 申請號: 201910314980.5
• 申請日: 2019-04-18
• 公開（公告）號: CN110157663B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 陳忠平
• 申請（專利權）人: 朗姿賽爾生物科技（廣州）有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 廣州一銳專利代理有限公司 44369
• 代理人: 楊昕昕

1.一種干細胞體外誘導培育心肌細胞的方法，其特征在于，S11.取自體干細胞制成單細胞懸液；S12.將單細胞懸液細胞計數后用分化培養基將其稀釋成細胞濃度為10^-5~10^-3cells/mL的干細胞懸液，接種于細菌培養皿的蓋子內表面上，翻轉培養皿蓋子，使蓋子上的干細胞形成懸滴，培養皿中加入水或水溶液以保持懸滴在孵育過程中的濕度，培養皿置于5%CO₂、37℃培養箱中培養1~3天；S13.收集培養皿蓋子上懸滴中形成的擬胚體，將其轉移到盛有分化培養基的細菌培養皿中，放入培養箱中繼續懸浮，促使擬胚體進一步增殖；S14.將制備好的擬胚體轉移到明膠包被的孔板，每孔一個擬胚體添加誘導分化培養基，進行干預分化培養；所述誘導分化培養基中包括丹酚酸B 0.7~1.2mg/L、人參皂苷0.5~1.5mg/mL、淫羊藿苷0.8~1.2mg/L；

所述人參皂苷的50%~60%制成微膠囊，將含有人參皂苷的微膠囊添加到培養基中，所述含有人參皂苷的微膠囊的制備方法為：S31. 將谷胱甘肽、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、去離子水按1:1:100~120，制得混合溶液，在混合溶液中加入pH=6的磷酸鹽緩沖溶液；所述磷酸鹽緩沖溶液中分散有改性納米四氧化三鐵顆粒，所述改性納米四氧化三鐵同磷酸鹽緩沖溶液的質量比為1:600，所述改性納米四氧化三鐵分散到磷酸鹽緩沖溶液中的方式為超聲分散；無氧條件下攪拌24h，反復吸附、洗滌，得到壁材，所述混合溶液同磷酸鹽緩沖溶液的體積比為1:6~8；S32.將人參皂苷分散于羥基硅油中，所述人參皂苷同羥基硅油的比例為1:100~120，得到芯材；S33.按體積比1:5的比例將壁材和芯材混合，在冰水浴下使用超聲探頭對油水兩相界面進行超聲5~10min，對產物進行多次吸附、洗滌，得到微膠囊；

所述人參皂苷的制備方法為：S41.將纖維素酶、果膠酶加入到去離子水中，同切成薄片的人參混合，45℃下反應1h，得到酶解提取液；S42.向酶解提取液中第一次加入95%的乙醇，55℃回流3h，過濾，得到初提液和殘渣，殘渣第二次加入95%的乙醇進行提取，55℃回流2h，同初提液合并，得到醇提液，所述第一次乙醇加入量：第二次乙醇加入量=1:4；S43.將醇提液在50℃減壓濃縮成浸膏狀，在濃縮過程中回收乙醇，得到的浸膏真空干燥既得人參皂苷；

所述改性納米四氧化三鐵的改性方法為：將納米四氧化三鐵分散在的去離子水中，加入納米層狀雙氫氧化物，超聲分散后干燥，得到納米層狀氫氧化物改性的納米四氧化三鐵，所述納米四氧化三體：納米層狀氫氧化物：去離子水=1:0.2~0.5：20；

所述納米層狀氫氧化物的制造方法為：將硝酸鋁和硝酸鋁溶于去離子水后，加入到劇烈攪拌的1.25%的氫氧化鈉溶液中，進行水熱反應，反應產物干燥后粉碎得到納米層狀氫氧化物；所述硝酸鋁：硝酸鎂：去離子水=1:0.75:30。

2.根據權利要求1所述的一種干細胞體外誘導培育心肌細胞的方法，其特征在于，所述誘導分化培養基中還包括GMEM培養基、胎牛血清、非必需氨基酸、50mmol/L的丙酮酸鈉水溶液和0.1mol/L的二巰基乙醇水溶液，所述GMEM培養基：胎牛血清：非必需氨基酸：50mmol/L的丙酮酸鈉水溶液：0.1mol/L的二巰基乙醇水溶液=73.5:24:1:1.3:0.2。

3.根據權利要求1所述的一種干細胞體外誘導培育心肌細胞的方法，其特征在于，所述纖維素酶、果膠酶、去離子水、人參的質量比為5×10^-4 :10^-3 :1:4。

4.根據權利要求1所述的一種干細胞體外誘導培育心肌細胞的方法，其特征在于，所述乙醇同酶解提取液的質量比為1:0.4。

5.根據權利要求1所述的一種干細胞體外誘導培育心肌細胞的方法，其特征在于，所述水熱反應的條件為：在80~120℃下反應48h。