[發明專利]一種誘導人多能干細胞體外分化為停滯在減數分裂II期的卵母細胞的方法

有效

• 申請號: 201910311538.7
• 申請日: 2019-04-18
• 公開（公告）號: CN110004112B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 俞曉麗;王寧;王翔;任亞輝;王華巖;張櫻馨;邱意開;蒲靜;劉心蕊;裴秀英;王燕蓉
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務所(普通合伙) 11870
• 代理人: 呂春艷

本發明公開了一種誘導人多能干細胞體外分化為停滯在減數分裂II期的卵母細胞的方法，該方法分為三步，首先將細胞密度為80％的多能干細胞更換PGC?m培養基，于35～40℃、3％～6％CO₂下培養10天，得原始生殖細胞樣細胞；然后將形成的原始生殖細胞樣細胞轉移至PF?m培養基中，于35～40℃、8％～12％CO₂下培養5天，得卵泡樣結構；最后將形成的卵泡樣結構轉移至OLC?m培養基中孵育10～15天，得到停止在減數分裂II期的卵母細胞樣細胞。采用本發明中的方法，效率高、時間短，而且誘導出的卵母細胞樣細胞可排除第一極體，形成次級卵母細胞。該方法為研究人類雌性生殖細胞的形成和卵子發生提供了新的手段。

技術領域

本發明屬于細胞工程技術領域，具體涉及一種誘導人多能干細胞體外分化為停滯在減數分裂II期的卵母細胞的方法。

背景技術

在沒有與原腸胚形成相關的形態發生事件存在的情況下，通過體外培養產生生殖細胞，是理解體外配子發生整個過程的有效途徑之一。許多研究表明，人和小鼠多能干細胞通過重建體外配子發生過程，可以產生功能性雄性配子和卵母細胞樣細胞(OLCs)。通常，通過懸浮培養將多能干細胞分化形成類胚體(EB)，其產生的類固醇激素可以促進原始生殖細胞樣細胞(PGCLC)的形成，然后將PGCLC在含有細胞因子(例如BMP4，SCF，EGF和LIF)的培養基中繼續培養，發育形成聚集體或卵泡樣結構，在添加豬卵泡液和類固醇激素的條件下，單層培養人羊水干細胞(hAFSCs)也可以分化為OLCs。首次證實小鼠胚胎干細胞在懸浮培養的條件下，可在30天左右自發分化形成OLCs，然而，OLC的染色體松散分布異常，難以觀察到清晰的細胞核。有研究證實通過體外構建重組卵巢，即來自小鼠胚胎干細胞的PGCLC和來自E12.5雌性性腺的體細胞，通過體外培養即可獲得成熟卵母細胞。盡管這種方法產生了完全成熟的卵母細胞，而且可以在體外進行受精，但它不能用于人類，因為胎兒性腺體細胞有悖倫理。最近，有研究證實，用人類多能干細胞誘導的卵原細胞樣細胞與小鼠胚胎卵巢體細胞重建并形成異種卵巢，其內攜帶具有表觀遺傳重編程的生殖細胞并進入減數分裂前期。值得一提的是，從小鼠多能干細胞中提取生殖細胞和雄性配子的方法，為成熟卵母細胞的體外形成奠定了基礎，但哺乳動物物種間生殖細胞發育的差異也是需要考慮的問題。最近，另一份研究證實，過表達DAZL和BOULE基因，可使人胚胎干細胞在體外培養添加GDF9和BMP15形成由卵母細胞和顆粒細胞混合的卵泡樣結構(FLs)，類似于初級卵泡，且卵母細胞能夠進入減數分裂。

將幾種生殖細胞特異性標記物Oct4，Stella，Gdf9和Daz1與GFP融合，以構建報告系統用于監測體外卵子發生的進程。研究顯示，構建人BMP15-EGFP報告基因并用于體外監測人OLC的形成，發現骨形態發生蛋白15(BMP15)是生殖細胞和卵母細胞功能發育的關鍵因子，只有當人羊水干細胞分化為卵母細胞樣細胞時才會被激活。Oct4表達在卵泡樣結構中顯示上調。結合Oct4和c-Kit(也稱為CD117)或EpCAM(上皮細胞粘附分子)純化能夠富集具有減數分裂能力的卵母細胞。此外，在PGCLC形成期間發現了涉及生殖細胞命運調節的幾個關鍵因子。SOX17是來自內胚層譜系的標記基因，在多能干細胞向hPGCLC命運形成時其關鍵作用。由BMP4激活的BLIMP1直接結合抑制細胞增殖基因的表達并誘導AP2γ，其與PRDM14一起啟動PGCLC特異性命運。為證實原始卵泡的形成，生殖細胞需要表達FIGLA和聯會復合蛋白3(SCP3)，然后激活透明帶(ZP)糖蛋白2合成。透明帶由三種硫酸化糖蛋白ZP1，ZP2和ZP3組成，是卵母細胞的關鍵部分，在卵子發生，受精和植入過程中起著重要作用。此外，DAZL和BOULE是兩種生殖細胞特異性RNA結合蛋白，能調節OCT4，BMP15，STELLA，VASA和PRDM1的表達，以促進PGC形成并進入減數分裂并調節配子的發育。卵母細胞與周圍顆粒細胞之間的細胞間通訊對卵泡的正常功能和發育至關重要。這種相互作用由間隙連接蛋白CX37和CX43相關。顆粒細胞特異性標志物FOXL2在卵母細胞生長中也具有非常重要的作用。這些重要基因的調節功能有助于我們從審視來源于人多能干細胞的PGCLC和OLC的形成。