[發明專利]一種誘導人多能干細胞體外分化為停滯在減數分裂II期的卵母細胞的方法

有效

• 申請號: 201910311538.7
• 申請日: 2019-04-18
• 公開（公告）號: CN110004112B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 俞曉麗;王寧;王翔;任亞輝;王華巖;張櫻馨;邱意開;蒲靜;劉心蕊;裴秀英;王燕蓉
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務所(普通合伙) 11870
• 代理人: 呂春艷

1.一種誘導人多能干細胞體外分化為停滯在減數分裂II期的卵母細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)誘導人多能干細胞形成原始生殖細胞樣細胞：待無飼養層培養條件下培養的人多能干細胞密度為80～85％時，更換PGC-m培養基，于35～40℃、3％～6％CO₂條件下培養10天，得原始生殖細胞樣細胞，培養過程中每天對培養基進行更換；所述人多能干細胞為hiPSC或hESC；所述PGC-m培養基為補充有KSR和bFF的α-MEM培養基，并且，所述PGC-m培養基中還添加有如下組分：

L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、b-巰基乙醇、抗生素、骨形態發生蛋白、白細胞抑制因子、干細胞因子、表皮細胞生長因子和ROCK抑制劑；

其中，所補充的KSR和bFF均占α-MEM培養基質量的3～6％，所添加的L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗生素均占α-MEM培養基質量的0.5～2％；所添加的b-巰基乙醇為0.05～0.15mM；所添加的骨形態發生蛋白、白細胞抑制因子、干細胞因子、表皮細胞生長因子和ROCK抑制劑在培養基中的濃度分別為：40～60ng/mL、150～250ng/mL、80～120ng/mL、40～60ng/mL和5～15μmol/L；

(2)誘導原始生殖細胞形成卵泡樣結構：將步驟(1)誘導形成的原始生殖細胞轉移至PF-m培養基中，于35～40℃、8％～12％CO₂條件下培養5天，得原始卵泡樣結構，培養過程中每天更換一半量的培養基；所述PF-m培養基以α-MEM為基礎培養基，添加如下組分形成：

KSR、bFF、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、b-巰基乙醇和抗生素；

PF-m培養基中所添加的KSR、bFF、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗生素分別占α-MEM培養基質量的5％、5％、1％、1％、1％；所添加的b-巰基乙醇為0.1mM；

(3)卵母細胞的體外成熟：將步驟(2)誘導形成的原始卵泡樣結構轉移至液滴培養基中，用礦物油覆蓋，然后置于OLC-m培養基孵育10～15天，每兩天更換一半培養基，得到停滯在減數分裂II期的卵母細胞樣細胞；所述OLC-m培養基以TCM 199為基礎培養基，添加如下組分形成：

牛血清蛋白、卵泡刺激素、人絨毛膜促性腺激素、孕馬血清促性腺激素、丙酮酸鈉、表皮生長因子和胰島素-轉鐵蛋白-硒。

2.根據權利要求1所述的誘導人多能干細胞體外分化為停滯在減數分裂II期的卵母細胞的方法，其特征在于：PGC-m培養基中所補充的KSR和bFF均占α-MEM培養基質量的5％；所添加的L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗生素均占α-MEM培養基質量的1％；所添加的b-巰基乙醇為0.1mM；所添加的骨形態發生蛋白、白細胞抑制因子、干細胞因子、表皮細胞生長因子和ROCK抑制劑在培養基中的濃度分別為：50ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL和10μmol/L。

3.根據權利要求1所述的誘導人多能干細胞體外分化為停滯在減數分裂II期的卵母細胞的方法，其特征在于：步驟(1)中多能干細胞在37℃、5％CO₂條件下進行培養。

4.根據權利要求1所述的誘導人多能干細胞體外分化為停滯在減數分裂II期的卵母細胞的方法，其特征在于：步驟(2)中原始生殖細胞在37℃、10％CO₂條件下進行培養。

5.根據權利要求1所述的誘導人多能干細胞體外分化為停滯在減數分裂II期的卵母細胞的方法，其特征在于：OLC-m培養基中所添加的牛血清蛋白、卵泡刺激素、人絨毛膜促性腺激素、孕馬血清促性腺激素、丙酮酸鈉和表皮生長因子在培養基中的濃度分別為：3mg/mL、5U/mL、10U/mL、10IU/mL、0.23μmol/L、10ng/mL，所添加的胰島素-轉鐵蛋白-硒占TCM 199培養基質量的1％。

6.根據權利要求1所述的誘導人多能干細胞體外分化為停滯在減數分裂II期的卵母細胞的方法，其特征在于：所述抗生素為青霉素和/或鏈霉素。