[發明專利]數字PCR的實驗方法

在審

• 申請號: 201910307243.2
• 申請日: 2019-04-16
• 公開（公告）號: CN109971839A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 閆志凌;徐開林;張煥新;孫乾;扈臣媛;韓雅慧;牛銘山
• 申請（專利權）人: 閆志凌
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 周宇

本申請實施例提供了數字PCR的實驗方法，屬于分子生物技術領域。本申請提供一種數字PCR的實驗方法，該數字PCR的實驗方法通過將PCR反應的試劑、引物等混合，然后將反應體系細分成大量的小液滴，分別進行PCR反應，該方法克服實時熒光定量PCR中樣品的擴增效率與校準物的擴增效率不同的，檢測結果的一致性更高。

技術領域

本發明涉及分子生物技術領域，具體而言，涉及數字PCR的實驗方法。

背景技術

RT-qPCR法作為檢測方法存在以下不足：第一、由于參照基因與目的基因擴增效率的差異、各實驗室間由于系統和人員技術的不同，導致目的基因擴增效率存在差異，需要定期相互參比檢測結果并建立特定修正系數，各檢測中心的數據通過系數修正后方可應用國際通用的標準去判定療效；第二、擬停藥的患者需達到更深層次的分子學緩解，而RT-qPCR技術對極低拷貝數的目標DNA無法檢測到。

發明內容

本申請實施例提供了一種數字PCR的實驗方法，通過建立一種數字PCR的方法，開放的實驗方法能檢測到極低濃度條件下樣本。

在本申請的第一方面，提供了一種數字PCR的實驗方法，數字PCR方法包括以下步驟：

根據待檢基因設計得到檢測引物；

提取待檢樣本的基因組DNA并進行處理，得到DNA模板并對待檢含量進行定量分析，稀釋至目標濃度，得到模板稀釋液；

將模板稀釋液、檢測引物與探針、數字PCR反應緩沖液混合，制備得到數字PCR反應混合液；

將數字PCR反應混合液分散到多個反應單元中，利用密封劑和密封液密封多個反應單元，進行數字PCR擴增反應；

讀取多個反應單元的數據并分析數字PCR擴增反應的結果。

實施例中，通過將樣本、引物等混合成混合液，然后通過將混合的反應液進行微液滴化，然后將液滴分散到單獨的反應單元中進行反應，快速反應。

在前述第一方面的一些實施例中，稀釋的倍數為10-100倍。

在實施例中，模板的濃度相對來說，一般都較高，直接進行數字PCR不合適，就需要進行稀釋；先對樣本進行定量，然后跟進行試驗需要的濃度進行稀釋，優化素顏條件。

在前述第一方面的一些實施例中，多個反應單元包括至少10000個。

在實施例中，通過較多的反應單元，可以保證樣本能足夠的分散，進行精確的反應。

在前述第一方面的一些實施例中，PCR反應的總體系為15μL，包括正向引物和反向引物各0.25μL、探針0.25μL、反應mix溶液7.5μL，模板稀釋液3μL，ddH₂O補足至15μL。

在實施例中，一次數字PCR的總反應體系控制在15μL，有利于反應混合液的分散，分成單獨的微小液滴；如果體系量偏大，就容易導致微小液滴偏大，導致反應數據異常。

在前述第一方面的一些實施例中，密封液的用量為220-250μL。

在實施例中，由于進行PCR擴增反應的時候，會將反應體系通過技術手段分成較多的小液滴，如果不采取密封，由于在反應過程中會加熱導致水分蒸發導致，反應被破壞，影響整體實驗的精確度，導致實驗的失敗。

在前述第一方面的一些實施例中，PCR反應的程序為95℃，10min；95℃，30s；50循環；50-55℃，60s；95℃，10min。

在實施例中，通過PCR程序，快速完成反應并進行產物的檢測，快速得出實驗結果。

在前述第一方面的一些實施例中，PCR反應的程序中的溫度變化速率為0.8-1.3℃/s。