[發明專利]一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法及其檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201910306028.0
• 申請日: 2019-04-16
• 公開（公告）號: CN109856393A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 范春雷;程向榮
• 申請（專利權）人: 浙江諾迦生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 周紅芳

本發明公開了一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法及其檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括檢測組試劑盒和對照組試劑盒兩種成分，所述檢測組試劑盒包括穩定表達人源μ型阿片受體MOR1基因的單克隆細胞系MOR1/SK?N?SH和ELISA檢測試劑盒，所述對照組試劑盒包括空白對照細胞系Neo/SK?N?SH和ELISA檢測試劑盒。本發明可實現所有阿片類活性物質的精確、高靈敏的快速檢測，無論是天然阿片類產品、還是合成阿片類分子，包括層出不窮的新型合成阿片活性物質，如芬太尼及其各種衍生物，可解決新型合成阿片類精神活性物質監管難的問題。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法及其檢測試劑盒。

背景技術

對于吸毒人員吸食新型阿片類精神物質，如芬太尼的檢測和監管是各國監管部門的難題。因為目前的檢測手段主要依賴于抗體(如抗芬太尼抗體)的免疫法，包括層析法、ELISA法等；以及氣質聯用、液質聯用等大型儀器分析。但芬太尼在人體內代謝較快，造成檢測樣本中目標檢測成分含量極低，無法檢測到。另一方面，新型合成的芬太尼層出不窮，且分子結構多樣，使基于抗體的免疫檢測法幾乎不可能，甚至氣質聯用、液質聯用也難以實現監管檢測。

發明內容

針對現有技術存在的上述技術問題，本發明的目的在于提供一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法及其檢測試劑盒。

本發明構思為：無論是天然阿片類物質，還是各種各樣的合成阿片類精神物質，如芬太尼及其衍生物，其在機體內都會作用到阿片受體這個靶點，從而產生其生物學效應。阿片受體至少包括μ型、k型、δ型、和σ型四種阿片受體，μ型阿片受體是嗎啡、芬太尼等阿片類精神物質親和力和作用最強的受體。阿片受體屬于GPCR類，當受到阿片類分子激動劑作用后信號通路激活，即通過IP3-DAG信號使內質網內儲存的Ca²⁺迅速釋放到的細胞質，胞質內游離鈣離子濃度升高，從而產生細胞應答，如神經細胞釋放多巴胺。由于多巴胺的測定有成熟的ELISA檢測試劑盒，因而我們通過建立穩轉MOR1的神經母細胞瘤細胞系MOR1/SK-N-SH，建立一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質檢測方法，應用于快速、高效、精準、高通量的檢測各種樣品中的阿片類活性物質。

所述的一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1）將阿片受體基因克隆到CMV啟動子下，構建真核表達質粒；

2）將步驟1）真核表達質粒轉染到神經母細胞瘤細胞，并建立阿片受體穩轉的神經母細胞瘤細胞系，進行培養擴增得到檢測組細胞培養液；同時建立一個轉染對照空載體的神經母細胞瘤細胞系，進行培養擴增得到對照組細胞培養液；

3）步驟2）檢測組細胞培養液中加入標準品并充分反應，標準品為嗎啡或芬太尼，配制一系列不同標準品濃度的標準液；將標準液離心分離后，取上清液并用ELISA檢測試劑盒檢測多巴胺效應下的吸光度OD值，以測得的吸光度OD值為縱坐標，以標準液中的標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算擬合回歸方程；

4）步驟2）檢測組細胞培養液中加入待測樣本，充分反應，離心分離后取上清液，對反應后的檢測組細胞培養液的上清液用ELISA檢測試劑盒檢測多巴胺效應下的吸光度OD₁值；步驟2）對照組細胞培養液中加入待測樣本，充分反應，離心分離后取上清液，對反應后的對照組細胞培養液的上清液用ELISA檢測試劑盒檢測多巴胺效應下的吸光度OD₂值；計算吸光度OD₁值與吸光度OD₂值之差，并帶入步驟3）回歸方程，即可推算出待測樣本中的阿片類活性物質的效應含量。