[發明專利]一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法及其檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201910306028.0
• 申請日: 2019-04-16
• 公開（公告）號: CN109856393A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 范春雷;程向榮
• 申請（專利權）人: 浙江諾迦生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 周紅芳

1.一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1）將阿片受體基因克隆到CMV啟動子下，構建真核表達質粒；

2）將步驟1）真核表達質粒轉染到神經母細胞瘤細胞，并建立阿片受體穩轉的神經母細胞瘤細胞系，進行培養擴增得到檢測組細胞培養液；同時建立一個轉染對照空載體的神經母細胞瘤細胞系，進行培養擴增得到對照組細胞培養液；

3）步驟2）檢測組細胞培養液中加入標準品并充分反應，標準品為嗎啡或芬太尼，配制一系列不同標準品濃度的標準液；將標準液離心分離后，取上清液并用ELISA檢測試劑盒檢測多巴胺效應下的吸光度OD值，以測得的吸光度OD值為縱坐標，以標準液中的標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算擬合回歸方程；

4）步驟2）檢測組細胞培養液中加入待測樣本，充分反應，離心分離后取上清液，對反應后的檢測組細胞培養液的上清液用ELISA檢測試劑盒檢測多巴胺效應下的吸光度OD₁值；步驟2）對照組細胞培養液中加入待測樣本，充分反應，離心分離后取上清液，對反應后的對照組細胞培養液的上清液用ELISA檢測試劑盒檢測多巴胺效應下的吸光度OD₂值；計算吸光度OD₁值與吸光度OD₂值之差，并帶入步驟3）回歸方程，即可推算出待測樣本中的阿片類活性物質的效應含量。

2. 如權利要求1所述的一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法，其特征在于步驟1）中，所述阿片受體基因為人源μ型阿片受體MOR1基因；所述真核表達質粒為pCMV-MOR1質粒，其構建過程為：將人源μ型阿片受體MOR1基因克隆到慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV啟動子下，連接酶切位點為EcoR I和Not I，構建真核表達質粒pCMV-MOR1。

3.如權利要求1所述的一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法，其特征在于步驟2）中，神經母細胞瘤細胞為SK-N-SH細胞；建立阿片受體穩轉的神經母細胞瘤細胞系的過程為：將pCMV-MOR1質粒、pH1質粒、pH2質粒共轉染至慢病毒包裝細胞293V，制備得到CMV-MOR1慢病毒；將CMV-MOR1慢病毒感染SK-N-SH細胞得到MOR1/SK-N-SH穩轉細胞，用含新霉素G418的條件培養基篩選MOR1/SK-N-SH穩轉細胞，并通過挑取克隆的方法獲得穩定表達人源μ型阿片受體MOR1基因的單克隆細胞系MOR1/SK-N-SH。

4.如權利要求1所述的一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法，其特征在于步驟2）中，建立一個轉染對照空載體的神經母細胞瘤細胞系的過程為：將pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo空載體、pH1質粒、pH2質粒共轉染至慢病毒包裝細胞293V，制備得到空載體慢病毒；將空載體慢病毒感染SK-N-SH細胞得到Neo/SK-N-SH穩轉細胞，用含新霉素G418的條件培養基篩選Neo/SK-N-SH穩轉細胞，并通過挑取克隆的方法獲得空白對照細胞系Neo/SK-N-SH。

5.如權利要求1所述的一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法，其特征在于步驟3）中，向檢測組細胞培養液中加入標準品并充分反應，配制標準品濃度分別為0.01、0.05、0.25、1.25、6.25ng/ml的5種標準液，所述標準品為嗎啡。

6.如權利要求1所述的一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法，其特征在于步驟3）中，向檢測組細胞培養液中加入標準品并充分反應，配制標準品濃度分別為1、3、9、27、81pg/ml的5種標準液，所述標準品為芬太尼。

7.如權利要求1所述的一種基于細胞多巴胺釋放效應的阿片類活性物質的檢測方法，其特征在于步驟4）中，所述待測樣本為吸毒人員的尿液、血液、毛發、頭皮屑、汗液或唾液，或者為天然大麻、天然大麻制品、合成大麻、合成大麻制品、污水、土壤、水塘中的任意一種。

8.一種阿片類活性物質的檢測試劑盒，其特征在于所述檢測試劑盒包括檢測組試劑盒和對照組試劑盒兩種成分，所述檢測組試劑盒包括穩定表達人源μ型阿片受體MOR1基因的單克隆細胞系MOR1/SK-N-SH和ELISA檢測試劑盒，所述對照組試劑盒包括空白對照細胞系Neo/SK-N-SH和ELISA檢測試劑盒。