[發明專利]可同步檢測3個酒精代謝基因4個SNP位點的多重PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201910301767.0
• 申請日: 2019-04-16
• 公開（公告）號: CN110004221A
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發明（設計）人: 趙方圓;佟洪梅;智慧芳;倪君君
• 申請（專利權）人: 北京和合醫學診斷技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 李厚銘

本發明公開了一種可同步檢測3個酒精代謝基因4個SNP位點的多重PCR檢測方法，所述4個SNP位點具體為ADH2基因的突變位點rs1229984，ALDH2基因的突變位點rs671，GABRA2基因的突變位點rs279858及rs279826；包括以下步驟：(1)根據4個SNP位點的上下游序列分別設計上游引物、下游引物；(2)配置多重PCR反應體系；(3)PCR擴增。本發明方法將PCR反應體系由4個體系/程序縮減至1個體系/程序，減少了DNA聚合酶、dNTP等試劑和耗材的使用量，可大幅度降低檢測成本。可以同時檢測4個位點，通過一次反應可以對4個位點進行SNP分型。可以同時檢測90多例樣本，不僅提高了檢測效率，也很大程度的節約了成本費用。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及一種可同步檢測3個酒精代謝基因4個SNP位點的多重PCR檢測方法。

背景技術

1、酒精代謝及相關基因

酒精中的主要成份為乙醇(CH₃CH₂OH)，飲酒后，乙醇在人體內的代謝主要依賴于乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶兩種酶的催化。大部分乙醇通過乙醇脫氫酶作用生成乙醛，再通過乙醛脫氫酶作用生成乙酸，然后進入氧化循環反應，最終代謝成二氧化碳和水排出體外。

乙醇脫氫酶由ADH2基因編碼，該基因位于4號染色體上，在3號外顯子的第143號堿基處具有多態性位點。該位點GG型編碼精氨酸，AA型編碼組氨酸。研究顯示，GG型表達產物乙醇脫氫酶活性較低，GA/AA型表達產物具有正常的乙醇脫氫酶活性，AA編碼的乙醇脫氫酶酶活性最高可以達到GG型的40倍，見表1。GG型聯合飲酒者和吸煙者因素能夠顯著增加上消化呼吸道腫瘤的風險。在中國人群中，ADH1B*1等位基因能增加食管癌患病風險，且飲酒可以增加這一風險。AG/GG基因型者罹患頭頸癌的風險較攜帶AA基因型者增加34％，說明該基因的多態性與中國漢族人群頭頸癌的易感性有關。

乙醛脫氫酶2(ALDH2)也是酒精代謝過程中關鍵酶之一，位于第12外顯子的Glu504Lys多態性位點(又稱rs671)，該位點發生堿基置換，即鳥嘌呤(G，野生型)被腺嘌呤(A，突變型)替代，導致該酶第504位氨基酸發生改變，即谷氨酸(glutamic acid，Glu)到賴氨酸(lysine，Lys)的替換。在人群中ALDH2基因型有3種情況，野生純合型(GG型又稱ALDH2*1/*1)，產生具有正常催化活性的酶；突變雜合型(GA型又稱ALDH2*1/*2)，產生的酶催化活性下降，僅為野生型酶活性的10％-45％；突變純合型(AA型又稱ALDH2*2/*2)，產生的酶活性僅為正常的1％-5％，見表1。

2、酒精依賴及相關基因

GABA(γ-氨基丁酸)是哺乳動物中樞神經系統中重要的抑制性神經傳達物質，約30％的中樞神經突觸部位以GABA為遞質。GABA的主要由兩類受體調控，分別為GABAA和GABAB。在GABAA的編碼基因GABRA2基因中，位于4號內含子的SNP位點(rs279826)和位于5號外顯子的SNP位點(rs279858)與酒精引起的神經沖動密切相關。rs279858A和rs279826T的個體發生酒精依賴的風險低，而rs279858GG和rs279858CC基因型在嗜酒的人群中發現較多，與酒精依賴的病人的飲酒及酗酒的高風險相關，見表1。

表1酒精基因及其主要突變

3、普通PCR及多重PCR

聚合酶鏈式反應(PCR)已被廣泛應用于醫學、遺傳學、微生物學乃至整個生命科學中。多重PCR是在常規PCR基礎上發展的一種新型擴增技術，即可在一個反應體系中加入兩對及兩對以上的引物，同時擴增多個核酸片段。多重PCR在微生物、遺傳病、腫瘤藥物基因組學有著重要的應用。