[發明專利]一種Rho-ROCK信號通路抑制劑Y27632對小鼠卵泡體外發育影響的研究方法

有效

• 申請號: 201910301109.1
• 申請日: 2019-04-15
• 公開（公告）號: CN110129402B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 俞曉麗;蒲靜;劉心蕊;羅曉強;邱意開;張櫻馨;王翔;裴秀英
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明公開了一種Rho?ROCK信號通路抑制劑Y27632對小鼠卵泡體外發育影響的研究方法，取出生后12天的小鼠卵巢，通過不同分離方法獲得腔前卵泡，采用微滴的方式進行卵泡生長和卵母細胞體外成熟培養。實驗設置空白對照組和含有Y27632的處理組。采用本發明的可以獲得較為理想的體外培養系統。通過本研究表明，該抑制劑的確可以降低卵泡發育過程中顆粒細胞的凋亡，這為卵泡的繼續發育提供了可靠保障。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種Rho-ROCK信號通路抑制劑Y27632對小鼠卵泡體外發育影響的研究方法。

背景技術

卵巢是雌性哺乳動物生殖內分泌功能的器官，其功能的發揮依賴于基本結構功能單位—卵泡。一個完整的卵泡的發育過程主要經歷顆粒細胞的包裹和增殖、卵泡膜細胞的出現、卵母細胞的成熟以及性激素調節等過程，根據顆粒細胞的層數大致分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡，前三者還沒有形成卵泡腔，因此又稱為腔前卵泡，后兩者則統稱為有腔卵泡。在人和動物一個完整的生命周期中，絕大多數的卵泡在腔前階段都會退化閉鎖。如何開發利用并避免生殖資源的浪費，使得卵泡的體外分離、培養甚至冷凍都成為發育生物學中的熱點。

Rho/Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信號通路是細胞骨架和細胞命運決定關鍵信號通路之一，能夠通過細胞微環境的調節參與細胞的增殖、遷移、分化和凋亡。該信號通路抑制劑Y27632通過與ATP競爭結合催化位點時限抑制胚胎干細胞的凋亡，而且對胚胎發生過程中，能夠通過TGF-β和SMAD信號通路抑制內胚層細胞的分化，而改善中、外胚層細胞的分化能力。該條信號通路通過對顆粒細胞的增殖對腔前卵泡的發育起到一定的調節作用。

發明內容

本發明的目的在于提出了一種Rho-ROCK信號通路抑制劑Y27632對小鼠卵泡體外發育影響的研究方法。通過較為成熟小鼠腔前卵泡體外培養體系中添加Y27632，探討其對顆粒細胞的增殖和卵母細胞發育的影響。為影響卵泡發育的分子機制提供新思路。

其技術方案如下：

一種Rho-ROCK信號通路抑制劑Y27632對小鼠卵泡體外發育影響的研究方法，

包括以下步驟：

步驟1、小鼠腔前卵泡的分離：體視鏡下獲得小鼠卵巢，在超凈工作臺內，用分離液清洗3次后，機械分離法：將卵巢轉移到含有2mL分離液的玻璃表面皿中，用解剖針在體視顯微鏡下鈍性分離卵泡，保證單側卵巢卵泡體外分離的時間不要超過30min。用培養液清洗三次后，檢出形態完整、直徑在100～130μm的卵泡。酶法：直接將卵巢放入消化液玻璃凹皿中，于37℃培養1h后，去掉消化液中的組織塊，加入卵泡培養液低速離心5min中后棄上清，再用培養液清洗兩次后，檢出形態完整的腔前卵泡進行培養。酶法-機械法：用消化液處理20min后，再采用上述機械法的分離方法。

步驟2、腔前卵泡的培養：選用直徑為60mm的培養皿，提前12h準備30μL升的卵泡培養液液滴，并在上面覆蓋2mL礦物油。用自制玻璃口吸管將分離獲得的腔前卵泡放入液滴中(1枚/個)于37℃培養箱培養，每2d半量換液，并收集培養液上清。

步驟3、卵泡RNA的提取、cDNA反轉錄及熒光定量PCR：收集5個培養前及培養后2d、4d、6d和8d的小鼠卵泡，在PBS中清洗3遍后，嚴格按照微量RNA提取試劑盒的說明書操作，用微量分光光度計檢測符合標準的RNA樣品可按照反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒進行相關基因的檢測。將結果輸入Graphpad?prism軟件進行分析和制圖。

步驟4、卵泡活性檢測：為評估并確定卵泡的存活率，按不同天數挑出的發育中的卵泡用熒光試劑Calcein?AM和Eethidium?homodimer(EthD-1)在黑暗條件下進染色中，在37℃培養箱中放置15min，然后在熒光顯微鏡下觀察卵泡的活性。其中EthD-1可進入已發生細胞膜破損或凋亡的細胞中，發出明亮的紅色熒光。根據顆粒細胞和卵母細胞都發出紅光的比例判斷卵泡的存活狀態。