[發明專利]一種Rho-ROCK信號通路抑制劑Y27632對小鼠卵泡體外發育影響的研究方法

有效

• 申請號: 201910301109.1
• 申請日: 2019-04-15
• 公開（公告）號: CN110129402B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 俞曉麗;蒲靜;劉心蕊;羅曉強;邱意開;張櫻馨;王翔;裴秀英
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

1.一種Rho-ROCK信號通路抑制劑Y27632對小鼠卵泡體外發育影響的研究方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、小鼠腔前卵泡的分離：

體視鏡下獲得小鼠卵巢，在超凈工作臺內，用分離液清洗3次后，采用機械分離法、酶法或酶法-機械法分離腔前卵泡，其中：機械分離法：將卵巢轉移到含有2mL分離液的玻璃表面皿中，用解剖針在體視顯微鏡下鈍性分離卵泡,保證單側卵巢卵泡體外分離的時間不要超過30min；用培養液清洗三次后，檢出形態完整、直徑在100~130um的卵泡；酶法：直接將卵巢放入消化液玻璃凹皿中，于37℃培養lh后，去掉消化液中的組織塊，加入卵泡培養液低速離心5min中后棄上清，再用培養液清洗兩次后，檢出形態完整的腔前卵泡進行培養；酶法-機械法：用消化液處理20min后，再采用上述機械法的分離方法；

步驟1中，所述分離液的成分為：L-15培養基+10%FBS+1%青/鏈霉素；

步驟1中，所述消化液的成分為：1mg/mL的膠原酶+0.1g/mL?Dnase；

步驟2、腔前卵泡的培養：

卵泡分為處理組和對照組，選用直徑為60mm的培養皿，提前12h準備30uL升的卵泡培養液液滴，并在上面覆蓋2mL礦物油；用自制玻璃口吸管將分離獲得的腔前卵泡放入液滴中于37℃培養箱培養，每2d半量換液，并收集培養液上清，處理組的卵泡培養液中添加Rho-ROCK信號通路抑制劑Y27632；

步驟3、卵泡RNA的提取、cDNA反轉錄及熒光定量PCR：

收集5個培養前及培養后2d、4d、6d和8d的小鼠卵泡，在PBS中清洗3遍后，嚴格按照微量RNA提取試劑盒的說明書操作，用微量分光光度計檢測符合標準的RNA樣品按照反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒進行相關基因的檢測；將結果輸入Graphpad?prism軟件進行分析和制圖；

步驟4、卵泡活性檢測：

為評估并確定卵泡的存活率，按不同天數挑出的發育中的卵泡用熒光試劑Calcein?AM和EthD-1在黑暗條件下進染色中，在37℃培養箱中放置15min，然后在熒光顯微鏡下觀察卵泡的活性；其中EthD-1進入已發生細胞膜破損或凋亡的細胞中，發出明亮的紅色熒光；根據顆粒細胞和卵母細胞都發出紅光的比例判斷卵泡的存活狀態；

步驟5、卵泡和卵母細胞的測量：

換液后，在倒置顯微鏡下觀察卵泡的發育情況并拍照，用ImageJ軟件測量卵泡和卵母細胞的長軸和短軸直徑，并且平均值作為卵泡和卵母細胞的直徑，同時記錄卵泡的存活情況；當觀察到卵泡的卵母細胞和/或顆粒細胞顏色變暗，在顯微鏡下沒有折光性時，則判斷為卵泡已發生死亡；

步驟6、統計學方法

結果采用SPSS21.0統計軟件進行分析，計量資料以均數+標準差(x+s)表示；各組間采用單因素方差分析比較；P0.05為差異有統計學意義；

所述卵泡培養液的成分為：α-MEM培養基+3%BSA+1%ITS+1%青/鏈霉素+0.5IU/mL?FSH+0.23mM?PNa+?50g/ml?Vc。