[發明專利]定性和/或定量檢測鼠李糖乳桿菌的特異性引物、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201910297977.7
• 申請日: 2019-04-15
• 公開（公告）號: CN109943655A
• 公開（公告）日: 2019-06-28
• 發明（設計）人: 鐘智;張和平;孫志宏;李偉程;高旭
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/225
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 代芳

本發明涉及定性和/或定量檢測鼠李糖乳桿菌的特異性引物、試劑盒和方法，屬于基因工程技術領域。本發明所述特異性引物包括上游引物M9F和下游引物M9R；所述上游引物M9F的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物M9R的序列如SEQ ID NO.2所示。本發明所述特異性引物能夠實現對鼠李糖乳桿菌M9快速準確地定性、定量檢測，特異性好、靈敏度高、穩定性好、重復性好。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及定性和/或定量檢測鼠李糖乳桿菌M9的特異性引物、試劑盒和方法。

背景技術

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)屬于乳桿菌屬，為革蘭氏陽性菌，無質粒，是人體正常菌群之一。其腸道黏著率高，定植能力強，能促進雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌生長，且有高效降膽固醇，促進細胞分裂，可起到調節腸道菌群、預防和治療腹瀉、排除毒素、預防齲齒、提高機體免疫力及抗癌等重要的生理保健功能。隨著技術的發展，越來越多的乳桿菌被發現，使得乳酸菌領域逐漸擴大。鼠李糖乳桿菌M9(Lactobacillus rhamnosusM9，M9)于2017年分離自健康婦女母乳，實驗室研究表明，M9對胃腸消化液具有良好的耐受性，且能夠以活的狀態進入人體腸道，對人體產生有益作用。但目前并沒有一種高效的檢測方法，實現不同樣品中M9的相對含量及其變化。

發明內容

本發明的目的在于提供定性和/或定量檢測鼠李糖乳桿菌M9的引物。本發明所述特異性引物能夠實現對鼠李糖乳桿菌M9快速準確地定性、定量檢測，能夠以糞便樣品為樣本快速定性、定量檢測糞便中是否含有鼠李糖乳桿菌M9及其含量，特異性好、靈敏度高、穩定性好、重復性好。

本發明提供了用于定性和/或定量檢測鼠李糖乳桿菌M9的特異性引物，所述特異性引物包括上游引物M9F和下游引物M9R；所述上游引物M9F的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物M9R的序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明還提供了基于上述技術方案所述特異性引物的定性和/或定量檢測鼠李糖乳桿菌M9的試劑盒，所述試劑盒包括上述技術方案所述的特異性引物。

優選的是，所述試劑盒還包括：標準品和PCR體系。

本發明還提供了基于上述技術方案所述特異性引物或上述技術方案所述試劑盒的定性檢測鼠李糖乳桿菌M9的方法，包括以下步驟：

1)提取待檢測樣品的DNA片段，作為模板DNA；

2)利用所述特異性引物對步驟1)得到的模板DNA進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；

3)對步驟2)得到的PCR擴增產物進行凝膠電泳檢測，263bp處出現單一條帶，說明待檢測樣品中含鼠李糖乳桿菌M9。

優選的是，步驟2)所述PCR擴增的條件為：94℃變性5min；94℃變性1min，54℃退火53s，72℃延伸2min，循環30次；72℃延伸7min。

優選的是，步驟3)所述凝膠電泳檢測的條件為：電壓為5V/cm，電泳時間為20～30min。

本發明還提供了基于上述技術方案所述特異性引物或上述技術方案所述試劑盒的定量檢測鼠李糖乳桿菌M9的方法，包括以下步驟：

(1)提取待檢測樣品的DNA片段，作為模板DNA；

(2)利用所述特異性引物對步驟(1)得到的模板DNA進行微滴生成，得到微滴；

(3)對步驟(2)得到的微滴進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；

(4)對步驟(3)得到的PCR擴增產物進行定量檢測。

優選的是，步驟(2)所述微滴生成為利用ddPCR系統使模板DNA形成油包水結構。