[發明專利]乙肝病毒前S1蛋白特異性抗體的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201910297150.6
• 申請日: 2019-04-15
• 公開（公告）號: CN110003326A
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發明（設計）人: 侯鵬云;代春迎;田曉平;趙巧輝;李桂林;付光宇;吳學煒;楊增利
• 申請（專利權）人: 鄭州伊美諾生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C12N5/20;G01N33/569;G01N33/577
• 代理公司: 鄭州異開專利事務所(普通合伙) 41114
• 代理人: 王霞

本發明公開了一種乙肝病毒前S1蛋白特異性抗體的制備方法，包括抗合成前S1多肽?1和抗合成前S1多肽?2的鼠單克隆抗體，制備時使用合成前S1片段多肽?1和多肽?2制備的人工抗原作為免疫原。使用抗合成前S1多肽?1的鼠單抗和抗合成前S1多肽?2的鼠單抗共同作為包被抗體，辣根過氧化物酶標記的抗HBsAg的抗體作為標記抗體，建立檢測血清中的前S1蛋白的ELISA方法，具有較高的靈敏度和特異性。申請人團隊在現有技術的基礎上，在前S1已知的B細胞識別位點（21aa?47aa）外尋找其他的B細胞識別位點，制備特異性鼠單克隆抗體，以提升前S1蛋白的檢出率，為臨床乙型肝炎病毒感染的早期篩查、預后診斷提供更精準的參考數據。

技術領域

本發明涉及體外診斷技術，尤其是涉及一種乙肝病毒前S1蛋白特異性抗體的制備方法，本發明還涉及該方法制備出的特異性抗體在檢測前S1蛋白試劑盒方面的應用。

背景技術

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是引起乙型肝炎(簡稱乙肝)的病原體，屬嗜肝DNA病毒科。該科病毒包含正嗜肝DNA病毒屬和禽嗜肝DNA病毒屬兩個屬，引起人體感染的是正嗜肝DNA病毒屬。HBV感染是全球性的公共衛生問題，嚴重威脅人類健康。乙肝病毒表面抗原（HBsAg）是位于乙型肝炎病毒顆粒外殼的一種膜蛋白，根據其組成可以分為三類：大蛋白（LHBs，包括前S1、前S2和S）、中蛋白（MHBs，包括前S2、S）、小蛋白（SHBs，僅包括S）。

HBV主要有三種不同的形態：小球形顆粒（直徑22nm）、管狀顆粒（直徑22nm、長度100-1000nm）、Dane顆粒。其中大蛋白主要分布在Dane顆粒和管狀顆粒上，具有很強的免疫原性。完整的HBV病毒顆粒外模的組成依賴于LHBs、MHBs、SHBs三種蛋白的共同作用，在LHBs缺少的情況下，HBV只能形成小球形顆粒，因此LHBs實際上代表著病毒外模的組裝能力。只有當LHBs蛋白濃度達到一定量時，HBV的管狀顆粒和Dane顆粒才能形成。因此，檢測LHBs實際上反應的是管狀顆粒和Dane顆粒的濃度，鑒于Dane顆粒代表著病毒基因在血液中的實際存在，因此可以根據檢測血液中LHBs的含量，來判斷病毒攜帶者體內的乙肝病毒是否進行復制。

目前臨床上用于檢測前S1蛋白的試劑盒中，使用的抗體一般都是利用重組大蛋白（LHBs）或者化學合成前S1片段作為免疫原來制備出的特異性單克隆抗體。在《乙型肝炎病毒大蛋白前S區抗原檢測試劑盒》（申請號200510077451.6）以及《乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區化學發光免疫分析測定試劑盒及其制備方法》（申請號200710176332.5）等公開的專利文獻中，認為在乙型肝炎病毒大蛋白上并不存在單獨的前S1區段，而是存在前S1和前S2組成的構象型前S區，由前S區和S區一塊構成大蛋白，單獨使用前S1片段制備單克隆抗體，在進行血清檢測時會導致不同程度漏檢。前S1區段的（21aa-47aa）氨基酸多肽序列高度保守，肝細胞表面存在其結合受體，一般認為該片段在HBV感染肝細胞的過程中起到重要作用。專利文獻（CN 101863975B）合成前S1區段內的（27aa-59aa）多肽和（83aa-111aa）多肽，來分別制備鼠單克隆抗體并混合使用作為包被抗體，用于檢測HBsAg陽性樣本，陽性檢出率為86%；用于檢測HBV DNA陽性樣本45例，陽性檢出率達到93.3%。

發明內容

本發明的目的是在現有技術的基礎上，提供一種新的乙肝病毒前S1蛋白特異性抗體的制備方法，以提升前S1蛋白的檢出率，為臨床乙肝病毒感染患者的早期篩查、預后診斷提供更精準的參考數據。

為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案：

本發明所述的乙肝病毒前S1蛋白特異性抗體的制備方法，包括抗合成前S1多肽-1和抗合成前S1多肽-2的鼠單克隆抗體，制備時使用合成前S1片段多肽-1和多肽-2制備的人工抗原作為免疫原。