[發明專利]一種鑒定動物體內NAB代謝產物的方法和評價NAB在動物體內暴露風險的方法

有效

• 申請號: 201910296030.4
• 申請日: 2019-04-12
• 公開（公告）號: CN109991355B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 張建勛;毛健;劉帥東;柴國璧;張啟東;曹保軍;李琛;王榮浩;王丁眾;張文娟;席輝;宋瑜冰;屈展
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 郭佳效

1.一種鑒定動物體內NAB代謝產物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將動物血液樣品進行離心，取上清液，向上清液中加入乙腈混合均勻后靜置，得到混合樣品；

2)將混合樣品進行離心，取上清液，固液分離，將所得液體進行超高效液相色譜串聯軌道阱高分辨質譜檢測；

所述超高效液相色譜串聯軌道阱高分辨質譜檢測的色譜條件為：色譜柱：WatersAtlantis HILIC silica column；柱溫：25℃；進樣量5μL，流速0.5mL/min；流動相A：10mmol/mL甲酸銨溶液，B：乙腈；洗脫梯度：0-2min內B由95％下降至85％，2-6min內由85％降至75％，于0.1min內升至95％，維持2min；

所述超高效液相色譜串聯軌道阱高分辨質譜檢測的質譜條件為：電加熱噴霧離子源，正離子模式，噴霧電壓3.5kV；鞘氣流速為9.9L/min，輔助氣流速為3.3L/min，毛細管加熱溫度為320℃，加熱器溫度為300℃；掃描模式采用Full MS/ddMS²，一級全掃描分辨率為70000，范圍為100-250m/z，自動增益控制為1e6，離子最大注入時間為50ms；二級掃描為數據依賴掃描，分辨率為17500，自動增益控制為1e5，最大注入時間為50ms，歸一化的碰撞能量為35％；

3)將步驟2)檢測得到的分子量測量值與NAB的代謝產物的理論分子量相比對，依據比對結果，鑒定動物體內NAB的代謝產物；所述NAB的代謝產物為NAB-N-氧化物，5-羰基-5-(3-吡啶基)-戊酸和5-羥基-5-(3-吡啶基)-戊酸。

2.如權利要求1所述的鑒定動物體內NAB代謝產物的方法，其特征在于，步驟1)中，所述動物血液樣品為使用NAB及其吡啶環氘代的同位素標記物NAB-pyridine-d₄同步暴露動物后收集得到的暴露動物血液樣品。

3.如權利要求1或2所述的鑒定動物體內NAB代謝產物的方法，其特征在于，步驟3)中，提取NAB、NAB-pyridine-d₄及其代謝物的母離子色譜峰，并進行質譜二級子離子質量信息比對，利用目標物與對應的氘代目標物的色譜保留時間一致和相應的二級子離子質量信息的一一對應，確證NAB的代謝產物。

4.如權利要求1所述的鑒定動物體內NAB代謝產物的方法，其特征在于，步驟1)中，所述靜置在冰浴中進行，靜置的時間為20-40min。

5.如權利要求1所述的鑒定動物體內NAB代謝產物的方法，其特征在于，步驟2)中，所述離心的溫度為1-6℃。

6.一種評價NAB在動物體內暴露風險的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將NAB暴露動物血液樣品進行離心，取上清液，向上清液中加入乙腈混合均勻后靜置，得到混合樣品；

2)將混合樣品進行離心，取上清液，固液分離，將所得液體進行超高效液相色譜串聯軌道阱高分辨質譜檢測；

所述超高效液相色譜串聯軌道阱高分辨質譜檢測的色譜條件為：色譜柱：WatersAtlantis HILIC silica column；柱溫：25℃；進樣量5μL，流速0.5mL/min；流動相A：10mmol/mL甲酸銨溶液，B：乙腈；洗脫梯度：0-2min內B由95％下降至85％，2-6min內由85％降至75％，于0.1min內升至95％，維持2min；

所述超高效液相色譜串聯軌道阱高分辨質譜檢測的質譜條件為：電加熱噴霧離子源，正離子模式，噴霧電壓3.5kV；鞘氣流速為9.9L/min，輔助氣流速為3.3L/min，毛細管加熱溫度為320℃，加熱器溫度為300℃；掃描模式采用Full MS/ddMS²，一級全掃描分辨率為70000，范圍為100-250m/z，自動增益控制為1e6，離子最大注入時間為50ms；二級掃描為數據依賴掃描，分辨率為17500，自動增益控制為1e5，最大注入時間為50ms，歸一化的碰撞能量為35％；

3)將步驟2)檢測得到的分子量測量值與NAB的α-羥基化代謝產物的理論分子量相比對，依據比對結果，鑒定動物體內NAB的α-羥基化代謝產物；所述NAB的α-羥基化代謝產物為5-羰基-5-(3-吡啶基)-戊酸和5-羥基-5-(3-吡啶基)-戊酸；

4)根據不同暴露時間下NAB及其α-羥基化代謝產物的濃度，繪制NAB及其α-羥基化代謝產物的濃度-時間曲線，計算曲線下面積AUC值，以α-羥基化代謝產物的AUC之和除以NAB的AUC計算α-羥基化系數；根據α-羥基化系數評價NAB的暴露風險。