[發明專利]一種可用于犬肝簇蟲檢測的引物及試劑盒

在審

• 申請號: 201910295762.1
• 申請日: 2019-04-12
• 公開（公告）號: CN109913568A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 王錦明;關貴全;劉軍龍;牛慶麗;高閃電;李有全;劉愛紅;劉志杰;殷宏;羅建勛;劉光遠;楊吉飛;任巧云;田占成;陳澤;獨軍政
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12N15/11
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

本發明公開了一種可用于檢測犬肝簇蟲的引物、檢測試劑盒及應用方法。本發明所述試劑盒包括SEQ ID No.1至SEQ ID No.5的五條引物，以及免疫層析試紙條。本發明的檢測試劑盒特異性強、靈敏度高、不需要昂貴的儀器；操作簡便、快速、成本低，特別適合犬肝簇蟲病的現場快速檢測和流行病學調查。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測動物寄生蟲的引物及試劑盒，確切講本發明涉及一種犬肝簇蟲的引物及試劑盒，和這種試劑盒非疾病檢測目的的使用方法。

背景技術

犬肝簇蟲病是通過吸血昆蟲-蜱傳播的原蟲病，由頂復門、真球蟲目、肝簇蟲屬的原蟲寄生于犬科動物引起。犬肝簇蟲病最早報道于1905年的印度，最先闡明了肝簇蟲的傳播是通過吞食感染蜱而引起的。患病動物主要表現為間歇性發熱、消瘦、貧血、肌肉過敏及共濟失調癥等。滅有有效的治療藥物，臨床上常用阿莫西林、環孢霉素、克林霉素及多西環素等抗菌藥物配合糖皮質激素類、阿司匹林等以緩解癥狀。到目前為止，可以引起犬肝簇蟲的病原有兩種，一種是犬肝簇蟲(Hepatozoon canis)，另一種為美洲肝簇蟲(Hepatozoonamericanum)。犬肝簇蟲分布范圍廣，可能與其媒介蜱(血紅扇頭蜱)的廣泛分布有關，該病在非洲、南歐、中東和亞洲均有報道；而美洲肝簇蟲主要分布于美洲。

我國關于犬肝簇蟲病的報道最早于2015年Xu等(2015)利用熒光定量PCR方法對采集自我國十個省份的1114只寵物犬的血液樣品，進行流行病學調查，結果顯示北京、河南、江蘇、陜西、新疆、陜西均有不同程度的流行。隨后，張羽等通過對廣西地區寵物肝簇蟲的流行病學調查顯示，其陽性率為0.625％。目前我國僅有兩例肝簇蟲感染的病例報道，其中一例疑似，一例確診(謝靜勻等，2016；張兆霞等，2018)。

據中國疾病與預防控制中心調查，我國寵物犬的數量已經超過一億，而且寵物作為伴侶動物，在人們的日常生活和精神需求上起著越來越重要的作用。寵物的各種疾病，會給飼養者的一定的精神和經濟上的損失。肝簇蟲病作為一種新發性的疾病，建立一種有效的檢測方法，對與該病的及早診斷和預防尤為必要。目前該病的檢測方法有血液涂片及肌肉切片鏡檢法；血液涂片效率低，容易出現漏檢和誤檢；肌肉組織切片法屬于創傷性檢測方法，具體使用時局限性較大。此外，還有ELISA、PCR、環介導恒溫擴增方法，這些方法敏感性高、高特異強，但操作相對復雜，有的還需要昂貴的設備(如ELISA和PCR)，有的還需要進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

發明內容

本發明提供一種可克服現有技術不足的可用于檢測犬肝簇蟲的引物、檢測試劑盒，以及這種試劑盒非疾病檢測目的的使用方法

本發明的一對可用于檢測犬肝簇蟲的外圍置換引物，其基因序列為：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

本發明與前述引物對配合使用的用于檢測犬肝簇蟲的交叉引物和探針引物，其序列為：交叉引物序列為SEQ ID No.3，兩條探針引物的序列分別為SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5。

本發明的犬肝簇蟲檢測試劑盒內至少包含有引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3，用FITC標記的探針引物SEQ ID No.4和用生物素標記的探針引物SEQ ID No.5，以及免疫層析試紙條。

為方便使用，本發明的犬肝簇蟲檢測試劑盒內還包括有：10×IsothermalAmplification Buffer、100mM MgSO₄、2.5mM dNTP mix，Bst DNA聚合酶。

本發明的試劑盒用于非疾病診斷目的檢測方法是：以提取的待檢樣品基因組DNA為模板，用試劑盒內的引物進行擴增，將擴增產物滴加至免疫層析試紙條，隨后將試紙條置于含有層析緩沖液中，根據試紙條上的質控線和檢測線顯色情況確定被檢樣品是否感染犬肝簇蟲。具體判定為：當質控線顯色，檢測線也顯色，則判定為陽性；當質控線顯色，檢測線不顯色，則判定為陰性；當質控線不顯色，則本次檢測結果無效。