[發(fā)明專利]一種提高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910294247.1
• 申請(qǐng)日: 2019-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN109852621A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張可偉;趙江哲;俞寧寧;張艷軍;樊彪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 成都佳劃信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51266
• 代理人: 余小麗

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種提高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法，通過鑒定水稻OsABCG18為CK轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，利用OsABCG18的內(nèi)源啟動(dòng)子序列，驅(qū)動(dòng)OsABCG18在水稻中超表達(dá)，通過定量PCR篩選表達(dá)較高的株系，測(cè)定轉(zhuǎn)基因株系的CK含量。本發(fā)明涉及到一種利用水稻細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsABCG18的內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)OsABCG18基因表達(dá)提高水稻地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法及其應(yīng)用；通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞分裂素含量測(cè)定和農(nóng)藝性狀分析，證明其能夠增加根部合成的細(xì)胞分裂素向地上組織運(yùn)輸?shù)哪芰Γ茉黾铀痉痔Y數(shù)、穗粒數(shù)并最終增加水稻籽粒產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法。

背景技術(shù)

目前，最接近的現(xiàn)有技術(shù)：

細(xì)胞分裂素(cytokinin,CK)是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、葉片衰老、抗病性以及非生物脅迫的重要激素，與作物產(chǎn)量、品質(zhì)以及適應(yīng)性等農(nóng)藝性狀關(guān)系密切。CK是一類N⁶-腺嘌呤的衍生化合物，根據(jù)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同可以分為類異戊二烯CK和芳香族CK。CK在植物體內(nèi)的合成途徑主要有從頭合成途徑，主要合成tZ類和iP類CK，和tRNA核苷酸補(bǔ)償途徑，用于合成cZ類CK，為植物體內(nèi)CK合成的次要途徑。為了保持體內(nèi)CK動(dòng)態(tài)平衡，植物主要通過CK氧化酶/脫氫酶(CKX)對(duì)其進(jìn)行氧化分解。CK基本信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由一個(gè)雙元組分系統(tǒng)(two-componentsystem)介導(dǎo)完成。CK首先與受體結(jié)合，通過磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用于下游的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育行為(Hwang et al.,2012)。CK的運(yùn)輸研究相對(duì)較少，目前在擬南芥中報(bào)道AtENT8、AtPUP14,和AtABCG14參與CK運(yùn)輸，其中AtABCG14負(fù)責(zé)CK從地下向地上的長(zhǎng)距離運(yùn)輸。在水稻中OsPUP4和OsPUP7被證明具有轉(zhuǎn)運(yùn)CK功能，但是負(fù)責(zé)根部向地上運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白尚未見報(bào)道。

CK具有促進(jìn)頂端分生組織功能，而過多的CK則抑制根分生組織的特點(diǎn)，增加地上組織CK可以促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量，在根部降低CK可以促進(jìn)根的發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)吸收，因此CK是育種家關(guān)注的重要激素之一。CKX基因突變會(huì)增加植物體內(nèi)CK的含量并提高種子數(shù)目，如擬南芥ckx3/ckx5雙突變體花的數(shù)目、果莢的數(shù)目及每個(gè)果莢中種子的數(shù)目都會(huì)明顯增加，種子產(chǎn)量提高50％(Bartrina et al.,2011)；水稻gn1a和dst(OsCKX2調(diào)節(jié)基因)突變體的水稻穗粒數(shù)增加20％以上(Ashikari et al.,2005；Li et al.,2013)。CKX突變可以提高地上組織CK的含量，不僅證明了增加CK的含量可以提高植物種子的數(shù)目和產(chǎn)量，而且提供了一種增加穗部CK的方法。但是依賴敲除CKX的方法增加CK的方法依賴于原始CKX基因的表達(dá)區(qū)域，尚不能系統(tǒng)提高地上組織的CK含量。CK長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)根部產(chǎn)生的CK向地上組織運(yùn)輸，通過超表達(dá)CK長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將根部產(chǎn)生的細(xì)胞分離素運(yùn)輸?shù)降厣辖M織，系統(tǒng)提高地上組織CK的含量，將能提供一種提高CK在地上組織含量的方法。迄今為止，該技術(shù)和方法尚未有相關(guān)報(bào)道。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：

(1)現(xiàn)有技術(shù)依賴敲除CKX的方法增加CK的方法依賴于原始CKX基因的表達(dá)區(qū)域，尚不能系統(tǒng)提高地上組織的CK含量。

(2)過表達(dá)CK長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將根部合成的CK運(yùn)輸?shù)降厣辖M織，系統(tǒng)提高地上組織CK的含量。

解決上述技術(shù)問題的難度：

要解決上述技術(shù)問題，需要在水稻植物中發(fā)現(xiàn)一種可以調(diào)控細(xì)胞分裂素向頂運(yùn)輸?shù)囊环N長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在水稻的半分子ABCG蛋白中篩選候選蛋白，后期需要通過不同的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)候選蛋白的細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行多方面的篩選，排除以及驗(yàn)證，從而解決所面臨的技術(shù)問題。功能確認(rèn)的蛋白最后需要在水稻中人為調(diào)控其表達(dá)水平，測(cè)定細(xì)胞分裂素在植物不同組織中的含量變化，以及由其所帶來的農(nóng)藝性狀的改變。