[發(fā)明專利]一種提高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910294247.1
• 申請日: 2019-04-12
• 公開（公告）號: CN109852621A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張可偉;趙江哲;俞寧寧;張艷軍;樊彪
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 成都佳劃信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51266
• 代理人: 余小麗

1.一種提高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法，其特征在于，所述提高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法包括：

鑒定水稻OsABCG18為CK轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白后，利用OsABCG18的內(nèi)源啟動(dòng)子序列，驅(qū)動(dòng)OsABCG18在水稻中超表達(dá)，并通過定量PCR篩選表達(dá)高的株系，再進(jìn)行測定轉(zhuǎn)基因株系的CK含量；

OsABCG18的cDNA序列如Seq ID No.1，或?yàn)椋喊ㄅcSeq ID No.1所示的cDNA序列至少有70％同源性地序列，以及對所述同源性地序列中一個(gè)或幾個(gè)替換，插入或缺失所獲得的功能類似物。

2.如權(quán)利要求1所述的高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法，其特征在于，利用OsABCG18的內(nèi)源啟動(dòng)子序列DNA序列如Seq ID No.2，或?yàn)椋号cSeq ID No.2的DNA序列具有至少有70％同源性地序列，以及對所述同源性地序列中一個(gè)或幾個(gè)替換，插入或缺失所獲得的序列。

3.如權(quán)利要求1所述的高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法，其特征在于，利用OsABCG18編碼蛋白的氨基酸序列為Seq ID No.3。

4.如權(quán)利要求1所述的高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法，其特征在于，所述提高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法具體包括：

1)獲得水稻CK轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體：

利用基因編輯技術(shù)，選取候選基因進(jìn)行基因編輯，鑒定具有CK轉(zhuǎn)運(yùn)的功能的ABC蛋白OsABCG18。

2)OsABCG18啟動(dòng)子的克隆：

提取水稻基因組DNA，擴(kuò)增OsABCG18啟動(dòng)子序列，連接到GUS報(bào)告表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植物；收獲T1代種子，在植物生長發(fā)育的不同階段進(jìn)行GUS染色。

3)OsABCG18pro-OsABCG18載體的構(gòu)建和OsABCG18基因的過量表達(dá)：

提取水稻根部RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板擴(kuò)增OsABCG18 CDS序列，連接到雙元表達(dá)載體，同時(shí)擴(kuò)增OsABCG18的啟動(dòng)子序列，構(gòu)建成由OsABCG18內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)OsABCG18表達(dá)的雙元表達(dá)載體。

4)OsABCG18過量表達(dá)植物的分析：

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入野生型水稻，利用定量PCR檢測外源基因的表達(dá)量，利用UPLC-MS方法測定CK的含量。

5.如權(quán)利要求4所述的高作物地上組織細(xì)胞分裂素含量的方法，其特征在于，OsABCG18過量表達(dá)植物的分析后，還需進(jìn)行對獲得的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行農(nóng)藝性狀分析。

6.一種包含權(quán)利要求1所述OsABCG18基因啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體OsABCG18pro-OsABCG18，其特征在于，所述表達(dá)載體OsABCG18pro-OsABCG18利用OsABCG18基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)OsABCG18基因或其同源基因進(jìn)行表達(dá)。