[發(fā)明專利]一種雪蚤抗凍蛋白SF-P的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910292940.5
• 申請(qǐng)日: 2019-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN110055257B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳金鴻;吳喬羽;楊丹璐;于穎;顧欣哲;龔盛祥;汪少蕓;王正武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C07K14/435;C12N15/70;A23L3/3526;C12N1/04;A01N1/02
• 代理公司: 上海旭誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發(fā)明公開了一種雪蚤抗凍蛋白SF?P的制備方法及應(yīng)用。所述抗凍肽是通過合成雪蚤抗凍肽基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體后表達(dá)純化得到的。首先將人工合成的SF?P編碼基因插入到PET28a?sumo載體中，構(gòu)建所述抗凍肽的表達(dá)質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行蛋白表達(dá)，用親和層析法對(duì)蛋白進(jìn)行純化后進(jìn)行酶切，獲得SF?P抗凍肽。大腸桿菌具有遺傳穩(wěn)定性，可以持續(xù)分泌表達(dá)外源基因，所獲重組工程菌株，可以高量、穩(wěn)定地分泌表達(dá)雪蚤抗凍肽SF?P，在抗凍蛋白領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物與食品技術(shù)領(lǐng)域，具體地本發(fā)明涉及一種雪蚤抗凍蛋白SF-P的制備方法其應(yīng)用。

背景技術(shù)

在寒冷環(huán)境中，生物體內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境會(huì)發(fā)生變化，具體表現(xiàn)為脫水形成結(jié)晶，因此造成細(xì)胞膜的破壞，進(jìn)一步導(dǎo)致生物體受到損傷，為了適應(yīng)極端寒冷環(huán)境，一些低溫生物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一類多肽或糖肽，幫助它們抵御寒凍危險(xiǎn)。這類多肽或糖肽稱作抗凍肽(antifreeze?peptide，AFP)，其由DeVries首在南極硬骨魚中發(fā)現(xiàn)，隨后證實(shí)具有抑制冰晶形成的功能。AFP具有特殊的抗凍活性，主要表現(xiàn)為：(1)能結(jié)合到冰晶表面并抑制冰晶進(jìn)一步生長(zhǎng)；(2)能以非依數(shù)形式降低溶液的冰點(diǎn)，使溶液的熔點(diǎn)和冰點(diǎn)之間出現(xiàn)差值，表現(xiàn)為熱滯活性；(3)具有冰重結(jié)晶抑制效應(yīng)。AFP可以避免細(xì)胞受到由冰晶導(dǎo)致的機(jī)械性損傷，因而其資源開發(fā)及應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注，在農(nóng)業(yè)低溫育種、冷凍食品加工與儲(chǔ)藏、醫(yī)藥行業(yè)上的廣泛的應(yīng)用發(fā)揮了一定的作用。

雪蚤抗凍蛋白(snow?flea?antifreeze?protein,SF-P)首次發(fā)現(xiàn)于加拿大，富含甘氨酸。目前經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)的雪蚤抗凍蛋白具有兩種同種型模體，分子量分別為6.5kDa和15.7kDa，后者具有更高的抗凍活性。雪蚤蛋白可以通過使體液凝固點(diǎn)降低6℃的方法來抑制冰晶的生成，此功能有助于避免雪蚤在暴露的積雪地面上結(jié)冰。經(jīng)過證實(shí)，雪蚤蛋白粗提物的熱滯活性高達(dá)6℃，比在魚類及植物中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)抗凍蛋白高一個(gè)或者兩個(gè)數(shù)量級(jí)。但是因?yàn)樽匀粭l件的苛刻，雪蚤體內(nèi)抗凍蛋白含量稀少，使得人們難以從雪蚤體內(nèi)直接分離純化，對(duì)其應(yīng)用價(jià)值造成了限制。因此，雪蚤抗凍蛋白SF-P的高效制備成為了研究熱點(diǎn)。大腸桿菌是目前廣泛采用的進(jìn)行活性蛋白或多肽生物表達(dá)的宿主，通過現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行結(jié)合基因工程菌，可得到活性較高的雪蚤抗凍蛋白，將其運(yùn)用于改善凍融產(chǎn)品的質(zhì)量、產(chǎn)品儲(chǔ)存、疾病治療等領(lǐng)域中，具有極大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何高效表達(dá)雪蚤抗凍蛋白SF-P。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種重組雪蚤抗凍肽SF-P的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：將人工合成的抗凍肽編碼基因構(gòu)建于克隆載體上；

步驟二：將含有所述抗凍肽表達(dá)序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行蛋白表達(dá)；

步驟三：用親和層析法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化；

步驟四：使用蛋白酶切開純化蛋白標(biāo)簽，獲得所述抗凍肽。

進(jìn)一步地，所述步驟一中，合成的的抗凍肽基因長(zhǎng)度為252bp，其基因序列如SEQID?NO.2所示。

進(jìn)一步地，所述克隆載體包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列如SEQ?ID?NO.1所示。

進(jìn)一步地，所述步驟一中，所述克隆載體為PET28a-sumo載體。

進(jìn)一步地，所述步驟二中，所述大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述步驟三中，所述親和層析法中所用層析柱為鎳柱。優(yōu)選參數(shù)如下：填料：Ni-Smart?6FF，流速為2mL/min。

進(jìn)一步地，所述步驟四中，所述蛋白酶為sumo蛋白酶，所切標(biāo)簽為His-sumo標(biāo)簽。