[發明專利]復制系統及其在基因表達中的應用

有效

• 申請號: 201910292682.0
• 申請日: 2019-04-12
• 公開（公告）號: CN109943514B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 吳瓊;姚繹;張文慧;張敏;金守紅
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/02
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 陸軍

本發明提供獲得目的基因表達產物的方法，包括在宿主菌中表達重組RNA分子，并在存在噬菌體RNA復制酶以及適合于目的基因表達的條件下培養所述宿主菌；其中所述重組RNA分子包含可被噬菌體RNA復制酶識別并進行RNA復制過程的5’復制識別序列和3’復制識別序列以及位于5’復制識別序列和3’復制識別序列之間的目的基因序列。本發明還提供可表達該重組RNA分子的重組菌。本發明的方法可以從直接增加RNA表達量的層面對工程菌進行改造，以促進目的基因的表達。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地說，涉及含有可復制的RNA序列在復制酶作用下增強靶基 因信使RNA及蛋白質含量中的用途。

背景技術

微生物發酵是現代工業生產中制備食品藥品的重要途徑，其依賴于經過人工改造的工業微生物。 對于很多天然微生物不能生產或者生產不佳的代謝產物，可以利用代謝工程在底盤菌株中引入新的代 謝通路(Steen,E.J.,Kang,Y.,Bokinsky,G.,Hu,Z.,Schiremer,A.,McClure,A.,Del Cardayre,S.B.,and Keasling,J.D.(2010).Microbialproduction of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass.Nature,463,559.)和調節已有代謝通路(Varma,A.,and Palsson,B.O.(1994).MetabolicFlux Balancing: Basic Concepts,Scientific and Practical Use.Bio/technology,12.)，從而使目的產物得到表達或使其表 達產量得到顯著提升。因此，構造能高效且穩定表達外源基因的工業菌株是微生物生產的核心步驟。

在過去的研究中，研究者們主要從以下四個層面對外源目的基因進行調節：DNA層面、轉錄層 面、RNA穩定性層面及翻譯層面。DNA層面主要包括目的基因表達形式的選擇，分別涉及基因組表 達和質粒表達。基因組表達相對穩定，突變及丟失情況低，但基因組的低拷貝數限制了其表達，同時 多個相同序列的插入會引發自發基因組重排問題；質粒系統表達能獲得更高的目的基因拷貝數，但在 生產培養中存在著質粒易丟失(Smith,M.A.,andBidochka,M.J.(1998).Bacterial fitness and plasmid loss: the importance ofculture conditions and plasmid size.Canadian journal of microbiology,44,351-355.)、 承載量有限、抗性選擇帶來生長壓力等問題。通常來講，基因組作為目的基因的表達載體更為合適， 但由于表達量瓶頸所限工業生產仍以質粒表達為主，如何提升基因組上的目的基因表達量是目前亟待 解決的問題之一。轉錄層面主要包括對目的基因使用的啟動子進行改造，目前已有大量研究，為菌種 改造提供了大量不同特性的啟動子。RNA穩定性層面主要包括對信使RNA序列進行設計，從而減弱 其降解速率(Carrier,T.A.,andKeasling,J.D.(1997).Controlling messenger RNA stability in bacteria:strategies for engineering gene expression.Biotechnology progress,13,699-708.)，目前研究相對較少。 翻譯層面主要包括對目的基因本身密碼子使用及其5’序列(包括核糖體結合位點等)的改造，使之更 適合在工業菌中表達。綜上，目前已有的研究從不同層面對工程菌進行了相應的優化改造，也取得了 長足的進步，但仍存在一些問題亟待解決。