[發明專利]復制系統及其在基因表達中的應用

有效

• 申請號: 201910292682.0
• 申請日: 2019-04-12
• 公開（公告）號: CN109943514B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 吳瓊;姚繹;張文慧;張敏;金守紅
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/02
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 陸軍

1.重組菌，其特征在于，所述重組菌能夠穩定表達重組RNA分子，其中所述重組RNA分子包括：(1)5’復制識別序列和3’復制識別序列，其可被噬菌體RNA復制酶識別并進行RNA復制過程；(2)位于5’復制識別序列和3’復制識別序列之間的目的基因序列；和(3)位于5’復制識別序列和3’復制識別序列之間的表達所述噬菌體RNA復制酶的序列；所述重組菌中穩定表達所述RNA復制酶；

其中，5’復制識別序列和3’復制識別序列包含Qβ噬菌體的5’非翻譯區和3’非翻譯區，所述噬菌體RNA復制酶為Qβ噬菌體RNA復制酶；或者5’復制識別序列和3’復制識別序列包含RQ135的5’非翻譯區和3’非翻譯區，所述噬菌體RNA復制酶為Qβ噬菌體RNA復制酶；

所述Qβ噬菌體的5’非翻譯區序列為

GGGTTCCCCCCGTAGGGGGGTACTCTATGTAGTAGCAACCATTACTGGAGGCAAC，

所述Qβ噬菌體的3’非翻譯區序列為

GGTAGCACCTGGGAGGGGTGCTATACGCACCCTAGGTTAGCAAACTTAAACTAACCTTCTCGAAAGAGAGAGTTGAGGGCTCTGCTTTGCCCTCACTCCTCCC，

所述RQ135的5’非翻譯區序列為

GGGTTCCAACCGGAAGTTGAGGGATGCCTAGGCATCCCCCGTGCGTCCCTT，

所述RQ135的3’非翻譯區序列為

TACGAGGGATTTGAGAGATGCCTAGGCATCTCCCGCGCGCCGGTTTCGGACCTCCAGTGCGTGTTACCGCACTGTTAGCCCA；

其中所述重組菌為重組大腸桿菌。

2.根據權利要求1所述的重組菌，其中所述重組RNA分子包含可形成發卡結構的序列。

3.根據權利要求2所述的重組菌，其中所述可形成發卡結構的序列中含有多個G和U，這些G和U可以相互配對使得該序列形成發卡結構，而與之互補的負鏈序列上不產生發卡結構。

4.根據權利要求1所述的重組菌，其中所述重組RNA分子包含位于5’復制識別序列上游和/或3’復制識別序列下游的可切割序列。

5.根據權利要求4所述的重組菌，其中位于5’復制識別序列上游的可切割序列是tRNA序列或HDV核酶序列。

6.根據權利要求4所述的重組菌，其中位于3’復制識別序列下游的可切割序列是tRNA序列或HDV核酶序列。

7.根據權利要求1-6任一項所述的重組菌，其中所述目的基因編碼蛋白。

8.根據權利要求7所述的重組菌，其中所述目的基因編碼的蛋白為酶。

9.根據權利要求7所述的重組菌，其中所述目的基因為選自由熒光蛋白BFP編碼基因，熒光蛋白GFP編碼基因，氯霉素編碼基因CmR、半乳糖激酶編碼基因GALK、β-半乳糖苷酶編碼基因LacZ、5-氨基乙酰丙酸合成基因Hem1構成的組的一個基因或兩個或更多個基因的組合。

10.根據權利要求1-6任一項所述的重組菌，所述重組菌中Rnc基因被敲除。

11.根據權利要求1-6任一項所述的重組菌，其所述重組菌由其基因組穩定表達所述重組RNA分子，或所述重組菌由存在于其中的表達質粒穩定表達所述重組RNA分子。

12.根據權利要求11所述的重組菌，其中所述重組菌通過向宿主菌中導入可以轉錄所述重組RNA分子的DNA分子而獲得。

13.獲得目的基因表達產物的方法，包括在存在噬菌體RNA復制酶以及適合于目的基因表達的條件下培養權利要求1-12任一項所述的重組菌。