[發明專利]一種狂犬病毒抗體檢測試紙及其制備方法與檢測方法有效
| 申請號： | 201910291451.8 | 申請日： | 2019-04-12 |
| 公開（公告）號： | CN109959789B | 公開（公告）日： | 2022-08-16 |
| 發明（設計）人： | 殷玉和;石晶;劉偉;王慧慧;王倩;丁秋雨;趙玉環;倪婷婷;王瑩;夏振強 | 申請（專利權）人： | 長春西諾生物科技有限公司 |
| 主分類號： | G01N33/569 | 分類號： | G01N33/569;G01N33/58;G01N33/531 |
| 代理公司： | 長春眾邦菁華知識產權代理有限公司 22214 | 代理人： | 劉微 |
| 地址： | 130000 吉林*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 狂犬病毒 抗體 檢測 試紙 及其 制備 方法 | ||
1.一種狂犬病毒抗體檢測試紙，由一端至另一端依次包括：包被狂犬病毒抗原的樣品墊、包被抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體的金標墊、包被檢測線和質控線的硝酸纖維素膜、以及吸水墊，其彼此相互重疊并貼于背板的上表面；其特征在于，
其中，樣品墊包被的狂犬病毒抗原為狂犬病毒樣顆粒，樣品墊包被的狂犬病毒抗原的蛋白濃度為0.5-2.0g/L，狂犬病毒樣顆粒的基本組裝元件包括狂犬病病毒G蛋白和M蛋白，其中G蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示，M蛋白基因序列如SEQ ID NO.2所示，狂犬病毒樣顆粒是由狂犬病毒CTN-1株糖蛋白經Bac-to-Bac桿狀病毒-Sf9昆蟲細胞表達系統表達的病毒樣顆粒；
檢測線包被有抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體，檢測線包被的抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體的蛋白濃度為1.0-2.0g/L；
質控線包被有金黃色葡萄球菌A蛋白，質控線包被的金黃色葡萄球菌A蛋白的蛋白濃度為1.0-2.0g/L；
抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體由膠體金標記，所述金標墊包被的抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體的蛋白濃度為50μg/ml；
并采用以下步驟制備：
S1、樣品墊制備：制備和純化狂犬病毒抗原，將純化后的狂犬病毒抗原用內含2％的Tween-20的20mM四硼酸鈉溶液稀釋成0.5-2.0mg/ml，噴涂于玻璃纖維素膜上，作為樣品墊；
S2、金標墊制備：用0.2mol/L K2CO3將25-40nm的膠體金溶液調節pH值為8.4后，將純化后檢驗合格的抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體按照蛋白濃度為50μg/ml，加入膠體金溶液中并繼續攪拌30分鐘；加入10％BSA至終濃度為1％，攪拌30分鐘，以10000r/min離心30分鐘，小心吸去上清液，沉淀物即為初步純化的膠體金標記的抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體，溶于含3％BSA、3％蔗糖、0.2％Tween-20和0.1％NaN3的20mmol/L Tris-HCl溶液，噴涂在玻璃纖維上，作為金標墊；
S3、硝酸纖維素膜包被：檢測線包被的為1.0-2.0g/L的抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體，包被液為含3％蔗糖的PBS，pH7.2；質控線包被的為1.0-2.0g/L的SPA，包被液為含3％蔗糖的PBS，pH7.2；
S4、試紙組裝：采用樣品單向層析組裝方式，在背板上的一端至另一端依次粘貼狂犬病毒抗原包被的樣品墊、吸附與狂犬病毒抗原相應的金標單克隆抗體纖維墊簡稱金標墊、硝酸纖維素膜上含有用純化的抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體溶液包被的檢測線和SPA包被的質控線、吸水墊，組裝后切條、密封，4-30℃保存。
2.如權利要求1所述的狂犬病毒抗體檢測試紙的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1、樣品墊制備：制備和純化狂犬病毒抗原，將純化后的狂犬病毒抗原用內含2％的Tween-20的20mM四硼酸鈉溶液稀釋成0.5-2.0mg/ml，噴涂于玻璃纖維素膜上，作為樣品墊；
S2、金標墊制備：用0.2mol/L K2CO3將25-40nm的膠體金溶液調節pH值為8.4后，將純化后檢驗合格的抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體按照蛋白濃度為50μg/ml，加入膠體金溶液中并繼續攪拌30分鐘；加入10％BSA至終濃度為1％，攪拌30分鐘，以10000r/min離心30分鐘，小心吸去上清液，沉淀物即為初步純化的膠體金標記的抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體，溶于含3％BSA、3％蔗糖、0.2％Tween-20和0.1％NaN3的20mmol/L Tris-HCl溶液，噴涂在玻璃纖維上，作為金標墊；
S3、硝酸纖維素膜包被：檢測線包被的為1.0-2.0g/L的抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體，包被液為含3％蔗糖的PBS，pH7.2；質控線包被的為1.0-2.0g/L的SPA，包被液為含3％蔗糖的PBS，pH7.2；
S4、試紙組裝：采用樣品單向層析組裝方式，在背板上的一端至另一端依次粘貼狂犬病毒抗原包被的樣品墊、吸附與狂犬病毒抗原相應的金標單克隆抗體纖維墊簡稱金標墊、硝酸纖維素膜上含有用純化的抗狂犬病毒抗原的單克隆抗體溶液包被的檢測線和SPA包被的質控線、吸水墊，組裝后切條、密封，4-30℃保存。
3.如權利要求1所述的狂犬病毒抗體檢測試紙的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
將待檢全血或血清樣本按1:50～1:100v/v稀釋，取50～100μL加入樣品墊上，室溫靜置10-20分鐘內判定結果，結果判斷方法為：
狂犬病病毒抗體陽性：質控線處，出現一條紅色條帶；肉眼觀察檢測線處，出現較弱的線甚至不顯色；
狂犬病病毒抗體陰性：在檢測線和質控線處，各出現一條紫紅色條帶；肉眼觀察檢測線越深，說明狂犬病病毒抗體越弱；
無效：僅在檢測線顯色，而質控線無明顯條帶出現，視為試紙條檢測無效。
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