[發明專利]一種快速檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法

在審

• 申請號: 201910291334.1
• 申請日: 2019-04-12
• 公開（公告）號: CN110031576A
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發明（設計）人: 孫堅;陳沖;蔣鵬;崔超月;廖曉萍;劉雅紅
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 廣州正明知識產權代理事務所(普通合伙) 44572
• 代理人: 成姍

本發明屬于生物檢測技術領域，特別涉及一種能夠檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的質譜方法，包括以下步驟:S1.細菌與藥物共培養：將待測細菌進行培養，得到培養液，并加入四環素類抗生素標準品溶液（四環素類抗生素的終濃度為140~160μg/mL），混勻后30~40℃條件下孵育6~10h；S2.樣品前處理：將孵育好的共培養物離心，吸取上清液，在靶板上進行點靶，自然晾干，隨后用α?氰基?4?羥基肉桂酸覆蓋并再次自然晾干；S3.樣品的測定和數據分析：將步驟S2中經過點靶后的靶板采用質譜法進行檢測，分析質譜范圍依四環素類抗生素的種類而定。本方法具有靈敏度高、準確度高及分辨率高的特點，適用于產四環素類抗生素降解酶細菌的檢測。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，特別涉及一種快速檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法。

背景技術

自1984年四環素降解酶機制首次報道以來，已有十余種四環素類抗生素降解酶基因被檢出，包括tet(X)，tet(34)，tet(37)和tet(47)-tet(56)等。其中，tet(X)基因尤為值得關注，它能夠通過羥基化作用降解第一代(如四環素，金霉素和土霉素)、第二代(如多西環素和米諾環素)、第三代(如替加環素)和第四代(如伊拉瓦環素)幾乎所有四環素類藥物(Jana L.Markley等，2018，Frontiers in Microbiology)。令人擔憂的是，近年來不斷有新的tet(X)亞型出現(如tet(X1)-tet(X4))，它們所引起的細菌耐藥性甚至多重耐藥性愈發嚴重。但針對該類耐藥基因及編碼酶蛋白的快速檢測仍然缺乏有效手段。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-MS)是質譜分析中常用的軟電離技術，具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等特點，適用于混合物及生物大分子的測定。近年來，該技術已被廣泛應用于碳青霉烯酶NDM(Jiajia Yu等，2018，Ann ClinMicrobiol Antimicrob)和脂質A修飾蛋白MCR(Laurent Dortet等，2018，J AntimicrobChemother)的快速檢測。

發明內容

本發明為了克服現有技術中的問題，提供了一種檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現：

一種檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，將待測樣品與四環素類抗生素標準品的共培養物作為實驗組，只含有四環素類抗生素標準品的溶液作為陽性對照組，采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法檢測；

若實驗組中四環素類抗生素特異性離子峰消失，則判定待測樣品為產四環素類抗生素降解酶的細菌；

若觀察到代表四環素類抗生素的特異性離子峰相對陽性對照組明顯減弱，判定該細菌產四環素類抗生素降解酶；

若觀察到代表四環素類抗生素的特異性離子峰相對陽性對照組幾乎不變，判定該細菌不會產出四環素類抗生素降解酶。

基于四環素降解酶作用機理，本發明創新性地將MALDI-TOF-MS技術應用于Tet(X4)及相關亞型等四環素類抗生素降解酶的快速檢測。

優選地，所述四環素類抗生素為四環素、金霉素、土霉素、多西環素、米諾環素、替加環素或伊拉瓦環素中的一種或多種。

本發明同時保護所述的檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，包括以下步驟:

S1.細菌與藥物共培養：將待測細菌進行培養，得到培養液，加入四環素類抗生素標準品溶液，至四環素類抗生素的濃度為140～160μg/mL，混勻后30～40℃條件下孵育6～10h；