[發明專利]一種快速檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法

在審

• 申請號: 201910291334.1
• 申請日: 2019-04-12
• 公開（公告）號: CN110031576A
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發明（設計）人: 孫堅;陳沖;蔣鵬;崔超月;廖曉萍;劉雅紅
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 廣州正明知識產權代理事務所(普通合伙) 44572
• 代理人: 成姍

1.一種檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，其特征在于，將待測樣品與四環素類抗生素標準品的共培養物作為實驗組，只含有四環素類抗生素標準品的溶液作為陽性對照組，采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法檢測；

若實驗組中四環素類抗生素特異性離子峰消失，則判定待測樣品為產四環素類抗生素降解酶的細菌；

若觀察到代表四環素類抗生素的特異性離子峰相對陽性對照組明顯減弱，判定該細菌產四環素類抗生素降解酶；

若觀察到代表四環素類抗生素的特異性離子峰相對陽性對照組幾乎不變，判定該細菌不會產出四環素類抗生素降解酶。

2.根據權利要求1所述的檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，其特征在于，所述四環素類抗生素為四環素、金霉素、土霉素、多西環素、米諾環素、替加環素或伊拉瓦環素中的一種或多種。

3.根據權利要求1所述的檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，其特征在于，包括以下步驟:

S1. 細菌與藥物共培養：將待測細菌進行培養，得到培養液，加入四環素類抗生素標準品溶液，至四環素類抗生素的濃度為140~160 μg/mL，混勻后30~40℃條件下孵育6~10h；

S2. 樣品前處理：將孵育好的共培養物離心，吸取上清液，在靶板上進行點靶，自然晾干，隨后用α-氰基-4-羥基肉桂酸覆蓋并再次自然晾干；

S3. 樣品的測定和數據分析：將經過點靶后的靶板采用質譜法進行檢測，分析質譜范圍依四環素類抗生素的種類而定。

4.根據權利要求3所述的檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，其特征在于，所述靶板用1%色譜級甲酸、色譜級丙酮和色譜級甲醇分別對靶板超聲10~15min，超聲完后在超純水中浸泡15~20min并再次用色譜級甲醇沖洗，晾干備用。

5.根據權利要求3所述的檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，其特征在于，所述步驟S3中設置的質譜條件為：質譜范圍，1~1000m/z，離子源20kv，線性反射器2.60~2.70kv，鏡頭5.5~6.5kv，激光頻率50Hz，脈沖離子萃取延遲114ns，激光能量50~60正線性離子模式。

6.權利要求5所述的檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，其特征在于，每個樣品選取100個檢測點，每個檢測點轟擊5次。

7.根據權利要求1或3所述的檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，其特征在于，所述方法為檢測Tet(X4)及相關亞型的四環素類抗生素降解酶。

8.根據權利要求3所述的檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，其特征在于，步驟S1中培養液的OD₆₀₀為2.0，pH=7.0。

9.根據權利要求3所述的檢測產四環素類抗生素降解酶細菌的方法，其特征在于，以四環素為四環素類抗生素的代表藥物進行檢測，分析質譜范圍為300~500m/z。