[發(fā)明專利]肺癌突變位點的突變率的檢測方法及試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910291054.0
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN110117653A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設計）人: 張曉妮;劉園園
• 申請（專利權）人: 深圳海普洛斯醫(yī)學檢驗實驗室
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858
• 代理公司: 深圳舍穆專利代理事務所(特殊普通合伙) 44398
• 代理人: 黃賢炬

1.一種肺癌突變位點的突變率的檢測方法，其特征在于，包括：

(1)對肺癌患者外周血的血漿樣本進行cfDNA的提取，獲得cfDNA提取物；

(2)針對肺癌相關的EGFR L858R位點設計第一突變型檢測探針和第一野生型檢測探針、第一引物和第二引物，并且針對肺癌相關的EGFR 19號外顯子缺失位點設計第二突變型檢測探針、第二野生型檢測探針、第三引物和第四引物；

(3)以所述cfDNA提取物為模板，進行ddPCR檢測，獲得含有敏感性突變位點的擴增產物；

(4)對所述擴增產物進行數(shù)據(jù)分析，獲得EGFR敏感性突變L858R和19Del的突變率，

其中，所述第一突變型檢測探針的序列為SEQ ID NO:5，所述第一野生型檢測探針的序列為SEQ ID NO:6，所述第一引物的序列為SEQ ID NO:1，所述第二引物的序列為SEQ IDNO:2，并且

所述第二突變型檢測探針的序列為SEQ ID NO:7，并且所述第二野生型檢測探針的序列為SEQ ID NO:8，所述第三引物的序列為SEQ ID NO:3，所述第四引物的序列為SEQ IDNO:4。

2.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，

在步驟(1)中，采用所述兩步純化法抽提血漿cfDNA。

3.根據(jù)權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，

在步驟(1)中，所述兩步純化法為：采用異丙醇沉淀cfDNA，去除雜質，然后采用無水乙醇沉淀cfDNA，去除雜質之后，去離子水進行洗脫，以獲得包含cfDNA模板的洗脫液。

4.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，

在步驟(2)中，所述第一突變型檢測探針、所述第一野生型檢測探針、所述第二突變型檢測探針和所述第二野生型檢測探針的3’端均具有MGB-NFQ修飾。

5.根據(jù)權利要求1或4所述的檢測方法，其特征在于，

所述第一野生型檢測探針和所述第二野生型檢測探針的5’端均具有FAM熒光基團修飾，并且所述第一突變型檢測探針和所述第二突變型檢測探針的5’端具有HEX熒光基團修飾。

6.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，

在步驟(4)中，所述數(shù)據(jù)分析包括熒光閾值的確定、檢測閾值的確定、以及陰陽性結果的判讀。

7.根據(jù)權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，

所述熒光閾值的確定包括空白對照組和陰性對照組熒光閾值的確定；所述檢測閾值的確定包括最低檢測限的陽性對照組閾值的確定；所述陰陽性結果的判讀包括依據(jù)陰性對照組、最低檢測限的陽性對照組以及強陽性對照組的數(shù)據(jù)分析對檢測結果進行分析、判定。

8.一種檢測肺癌突變位點的突變率的試劑盒，其特征在于，是根據(jù)權利要求1至7中的任一項所述的檢測方法檢測的試劑盒。

9.一種檢測肺癌突變位點的突變率的試劑盒，其特征在于，

包括針對肺癌相關的EGFR L858R位點設計第一突變型檢測探針和第一野生型檢測探針、第一引物和第二引物，并且針對肺癌相關的EGFR 19號外顯子缺失位點設計第二突變型檢測探針、第二野生型檢測探針、第三引物和第四引物。

10.根據(jù)權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，

所述第一突變型檢測探針的序列為SEQ ID NO:5，所述第一野生型檢測探針的序列為SEQ ID NO:6，所述第一引物的序列為SEQ ID NO:1，所述第二引物的序列為SEQ ID NO:2，并且

所述第二突變型檢測探針的序列為SEQ ID NO:7，并且所述第二野生型檢測探針的序列為SEQ ID NO:8，所述第三引物的序列為SEQ ID NO:3，所述第四引物的序列為SEQ IDNO:4。