[發(fā)明專利]一種食品中牛源成分快速檢測(cè)方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910290331.6
• 申請(qǐng)日: 2019-04-11
• 公開（公告）號(hào): CN110055340B
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許文濤;羅云波;黃昆侖;杜再慧;張超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/6888
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明提供一種食品中牛源成分快速檢測(cè)方法及試劑盒，涉及生物物種鑒定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先篩選出一個(gè)牛源通用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因GAL，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其位于第29染色體上，在牛物種中拷貝數(shù)恒定，不存在等位基因變異，可作為鑒定牛源的靶基因。以該基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)了LAMP擴(kuò)增引物，與LAMP反應(yīng)液一起進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，LAMP反應(yīng)產(chǎn)物用于膠體金核酸試紙條檢測(cè)。LAMP反應(yīng)結(jié)合膠體金核酸試紙條檢測(cè)構(gòu)成快速檢測(cè)試劑盒，可快速、靈敏地檢測(cè)食品中的牛源成分，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.16％(w/w)。本發(fā)明試劑盒使用方法簡(jiǎn)單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物物種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)涉及一種檢測(cè)食品中牛源成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)結(jié)合膠體金核酸試紙條檢測(cè)的快速檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人民生活水平的提高，我國(guó)居民對(duì)肉類食品的需求逐年增加。盡管許多國(guó)家明確規(guī)定要求食品標(biāo)簽真實(shí)明確地標(biāo)出肉的種類、來(lái)源，禁止摻假行為，但是市場(chǎng)上仍有很多肉類摻假的事件發(fā)生，例如為了降低成本，驢肉火燒中摻入了豬肉，牛肉中摻入馬肉或豬肉，香腸中摻雜其他肉類等等行為。目前，對(duì)于食品摻假的檢測(cè)方法主要是PCR方法。PCR方法需要依靠特殊儀器，且最終結(jié)果的判斷需要瓊脂糖凝膠電泳完成，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，本發(fā)明目的是提供一種食品中牛源成分的快速靈敏檢測(cè)試劑盒。

目前，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因已被廣泛地用于鑒別食品摻假，但如何篩選出合適的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因顯得尤為重要。目前國(guó)內(nèi)外的肉制品摻假檢測(cè)技術(shù)多是針對(duì)線粒體上的基因設(shè)計(jì)特異引物來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，由于線粒體基因?yàn)槎嗫截惢颍錂z測(cè)靈敏度高，但同時(shí)在區(qū)分由于銷售、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程所產(chǎn)生的無(wú)意識(shí)交叉污染與有意識(shí)的非法添加時(shí)存在困擾。另外，高拷貝數(shù)線粒體DNA的濃度無(wú)法和基因組DNA的濃度相對(duì)應(yīng)，因此無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行精確定量分析，同時(shí)由于線粒體基因同源性極高，難以通過(guò)普通PCR實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)。因此，該方法只能借助熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)肉類摻假的篩選鑒別。若要鑒別低濃度的無(wú)意交叉污染和有意非法添加并明確摻假比例實(shí)現(xiàn)快速篩查，則要選擇染色體上的低拷貝基因作為肉類內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isotherm amplification,LAMP)是由Notomi于2000年開發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和兩對(duì)特殊的引物,特異地識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域,在等溫條件下(65℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。

膠體金核酸試紙條是依靠抗原與抗體的特異性結(jié)合，因此其具有極高的靈敏度。本發(fā)明將LAMP技術(shù)同膠體金核酸試紙條檢測(cè)結(jié)合起來(lái)，提供一種食品中牛源成分的快速靈敏檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明無(wú)需復(fù)雜的儀器，時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，完全可以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)食品中牛源成分的牛源通用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。

本發(fā)明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)食品中牛源成分的LAMP結(jié)合膠體金核酸試紙條檢測(cè)的快速檢測(cè)試劑盒。

一種用于檢測(cè)食品中牛源成分的基因，其為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因GAL，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

本發(fā)明提供了上述內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因GAL在檢測(cè)牛源成分中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因GAL在食品中牛源成分鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)上述內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因GAL的特異性LAMP引物組合，包括以下4條引物：

F3：5’-ACACTCCACCTCCCTCCT-3’(SEQ ID NO.2)；

B3：5’-ATTTGAACTGGGTGCCTCC-3’(SEQ ID NO.3)；