[發(fā)明專利]一種Pull-down鑒定污染物分子靶點(diǎn)的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910290115.1
• 申請(qǐng)日: 2019-04-11
• 公開（公告）號(hào): CN110045128A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳聯(lián)國;孫玉苗;胡陳艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院水生生物研究所
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/50
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

本發(fā)明公開了一種鑒定污染物分子蛋白靶點(diǎn)的方法，步驟是：(1)將污染物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，將污染物固定在瓊脂糖微珠上形成復(fù)合物；(2)將待測(cè)樣品組織裂解液與復(fù)合物共同孵育，使蛋白吸附到復(fù)合物上；(3)清洗復(fù)合物，去除與污染物非特異性結(jié)合的蛋白雜質(zhì)；(4)通過復(fù)合物與上樣緩沖液共孵育，釋放污染物結(jié)合蛋白；(5)通過分離蛋白條帶，切膠，并進(jìn)行膠內(nèi)還原、酰化和酶切處理，回收多肽條段；(6)污染物結(jié)合蛋白的多肽條段通過鳥槍法蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析，確定污染物特異性結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白。此方法簡單易行，操作方便，可直接從組分復(fù)雜的組織裂解液中尋找污染物的分子結(jié)合靶蛋白。通過后期不同驗(yàn)證手段可保證靶點(diǎn)篩選結(jié)果的可靠性。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及靶點(diǎn)識(shí)別領(lǐng)域，更具體涉及一種Pull-down鑒定污染物分子靶點(diǎn)的有效方法，適用于從組織勻漿液中直接捕獲并鑒定污染物的靶標(biāo)蛋白，明確污染物毒性效應(yīng)的關(guān)鍵分子起始事件，構(gòu)建毒性相關(guān)的有害結(jié)局通路，為預(yù)測(cè)毒理學(xué)提供新的研究模型。

背景技術(shù)

眾所周知，環(huán)境污染物可引起多種毒性效應(yīng)和健康危害，包括內(nèi)分泌紊亂、神經(jīng)毒性、心血管疾病、肝毒性、免疫抑制和發(fā)育毒性等。然而，對(duì)大多數(shù)污染物來說，其毒性作用機(jī)制仍不清楚。這些毒性效應(yīng)是污染物直接引起的還是間接引起的，仍然是未知的。因此，亟需一種可行可靠的鑒定污染物分子靶點(diǎn)的方法，幫助申請(qǐng)人更好地了解污染物的致毒機(jī)制。

分子靶點(diǎn)“鉤釣”技術(shù)是目前國際上靶點(diǎn)識(shí)別的主流方法，尤其在藥物的靶點(diǎn)識(shí)別方面有廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)的基本思路是將藥物分子通過化學(xué)反應(yīng)固定在微球表面，當(dāng)待測(cè)樣品裂解液與微球接觸時(shí)，能與藥物分子特異結(jié)合的蛋白被捕獲且被富集到微球表面，從而分離得到藥物分子的靶蛋白。該方法的基本實(shí)驗(yàn)步驟是：首先對(duì)藥物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，將一個(gè)標(biāo)簽分子(如生物素)連接到修飾后的藥物分子上，然后利用標(biāo)簽分子與微球的化學(xué)反應(yīng)將藥物分子間接連接到微球表面；將待測(cè)樣品裂解液與微球共同孵育，使能與藥物分子相互作用的靶蛋白被富集在微球上；洗脫得到藥物分子的結(jié)合蛋白；通過SDS-PAGE分離結(jié)合蛋白；將分離得到的結(jié)合蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析以及數(shù)據(jù)庫比對(duì)，確定藥物分子的靶蛋白。分子靶點(diǎn)“鉤釣”技術(shù)目前在靶點(diǎn)識(shí)別領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，且發(fā)展相對(duì)成熟，可操作性強(qiáng)。然而，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的低豐度蛋白尤其是痕量蛋白，該技術(shù)識(shí)別與鑒定能力有限。此外，在該技術(shù)的使用過程中，位阻較大的親和標(biāo)簽的引入可能會(huì)導(dǎo)致化合物的活性降低甚至喪失。

Pull-down技術(shù)是體外檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的有效方法。其基本思路是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上，當(dāng)待測(cè)樣品裂解液與該基質(zhì)接觸時(shí)，能與固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附到基質(zhì)上，然后洗去未被吸附的雜質(zhì)，將吸附到基質(zhì)上的蛋白洗脫下來，得到相互作用的蛋白。通過Pull-down技術(shù)既可用來尋找與已知蛋白相互作用的未知蛋白，也可用于驗(yàn)證已知蛋白之間的相互作用。目前常用的Pull-down方法是帶谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽(GST-tag)的親和純化柱進(jìn)行的GST Pull-down。其基本步驟是：利用基因重組技術(shù)構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體，然后通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，從而獲得帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白；將帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白固定到谷胱甘肽層析柱上；將可能含有目的蛋白的溶液過柱，與融合蛋白發(fā)生相互作用的蛋白被吸附到谷胱甘肽層析柱上；切掉標(biāo)簽，洗脫得到與融合蛋白相互作用的蛋白；最后通過SDS-PAGE分離。此方法簡單易行，操作方便，且特異性強(qiáng)。然而GST標(biāo)簽的引入可能會(huì)影響融合蛋白的構(gòu)象，同時(shí)標(biāo)簽本身也可能和部分蛋白結(jié)合，從而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性。

在Pull-down方法的基礎(chǔ)上，申請(qǐng)人對(duì)污染物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，但不改變其與蛋白靶點(diǎn)的結(jié)合特性。將修飾后的污染物通過化學(xué)作用固定在瓊脂糖微珠上，形成復(fù)合物。被固定的污染物充當(dāng)誘餌，直接從目的溶液的蛋白混合物中捕獲與污染物相互作用的蛋白。該方法對(duì)研究污染物毒性作用機(jī)制具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容