[發明專利]一種Pull-down鑒定污染物分子靶點的方法在審
| 申請號： | 201910290115.1 | 申請日： | 2019-04-11 |
| 公開（公告）號： | CN110045128A | 公開（公告）日： | 2019-07-23 |
| 發明（設計）人： | 陳聯國;孫玉苗;胡陳艷 | 申請（專利權）人： | 中國科學院水生生物研究所 |
| 主分類號： | G01N33/68 | 分類號： | G01N33/68;G01N33/50 |
| 代理公司： | 武漢宇晨專利事務所 42001 | 代理人： | 王敏鋒 |
| 地址： | 430072 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 污染物 復合物 污染物分子 組織裂解液 結合蛋白 靶點 多肽 條段 非特異性結合 瓊脂糖微珠 上樣緩沖液 特異性結合 靶點蛋白 靶點篩選 待測樣品 蛋白吸附 蛋白雜質 蛋白質組 分離蛋白 分子結合 質譜分析 靶蛋白 共孵育 鳥槍法 種鑒定 孵育 酶切 切膠 去除 條帶 修飾 酰化 還原 清洗 蛋白 驗證 回收 釋放 保證 | ||
【權利要求書】：
1.一種鑒定污染物分子蛋白靶點的方法，其步驟是：
(1)將污染物的結構進行修飾，通過化學反應將污染物固定在瓊脂糖微珠上形成復合物，不影響其毒性作用基團；
(2)待測樣品組織裂解液(320mM蔗糖、10mM Tris-HCl、羅氏完全蛋白酶抑制劑，pH7.4)與復合物共同孵育，使與污染物相互作用的蛋白吸附到復合物上，離心分離復合物；
(3)清洗復合物，去除與污染物非特異性結合的蛋白雜質；
(4)通過復合物與5×SDS-PAGE上樣緩沖液共孵育，釋放污染物結合蛋白；
(5)通過SDS-PAGE分離蛋白條帶，切膠，然后用二硫蘇糖醇進行膠內還原，再經碘乙酰胺酰化和胰蛋白酶切處理，回收多肽條段；
(6)污染物結合蛋白的多肽條段通過鳥槍法蛋白質組質譜分析和物種蛋白數據庫檢索注釋，鑒定結合蛋白的種類和豐度，與陰性對照比較和多種分子手段驗證，確定污染物特異性結合的靶點蛋白。
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