[發明專利]一種食品中綿羊源成分快速檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201910289658.1
• 申請日: 2019-04-11
• 公開（公告）號: CN109811066B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 許文濤;羅云波;黃昆侖;張超;杜再慧;馬玉婷
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種食品中綿羊源成分快速檢測試劑盒，涉及生物物種鑒定技術領域。本發明首先篩選出一個綿羊源通用內標準基因Calponin，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在綿羊物種中拷貝數恒定，不存在等位基因變異，可作為鑒定綿羊源的靶基因。以該基因為靶序列設計了LAMP擴增引物，與LAMP反應液一起進行恒溫擴增，LAMP反應產物用于膠體金核酸試紙條檢測。LAMP反應結合膠體金核酸試紙條檢測構成快速檢測試劑盒，可快速、靈敏地檢測食品中的綿羊源成分，檢測靈敏度可達0.16％(w/w)。本發明試劑盒使用方法簡單、成本低廉，反應結果易于觀察，特異性好，非常適用于現場實時檢測。

技術領域

本發明涉及生物物種鑒定技術領域，具體的說涉及一種檢測食品中綿羊源成分的環介導等溫擴增技術(LAMP)結合膠體金核酸試紙條檢測的快速檢測試劑盒。

背景技術

隨著經濟的高速發展，人民生活水平的提高，我國居民對肉類食品的需求逐年增加。盡管許多國家明確規定要求食品標簽真實明確地標出肉的種類、來源，禁止摻假行為，但是市場上仍有很多肉類摻假的事件發生，例如為了降低成本，驢肉火燒中摻入了豬肉，羊肉中摻入牛肉或豬肉，香腸中摻雜其他肉類等等行為。目前，對于食品摻假的檢測方法主要是PCR方法。PCR方法需要依靠特殊儀器，且最終結果的判斷需要瓊脂糖凝膠電泳完成，整個過程耗時較長。因此，本發明目的是提供一種食品中綿羊源成分的快速靈敏檢測試劑盒。

目前，內標準基因已被廣泛地用于鑒別食品摻假，但如何篩選出合適的內標準基因顯得尤為重要。目前國內外的肉制品摻假檢測技術多是針對線粒體上的基因設計特異引物來進行實時熒光定量PCR擴增，由于線粒體基因為多拷貝基因，其檢測靈敏度高，但同時在區分由于銷售、運輸等過程所產生的無意識交叉污染與有意識的非法添加時存在困擾。另外，高拷貝數線粒體DNA的濃度無法和基因組DNA的濃度相對應，因此無法對樣品進行精確定量分析，同時由于線粒體基因同源性極高，難以通過普通PCR實現定性檢測。因此，該方法只能借助熒光定量PCR實現肉類摻假的篩選鑒別。若要鑒別低濃度的無意交叉污染和有意非法添加并明確摻假比例實現快速篩查，則要選擇染色體上的低拷貝基因作為肉類內標準基因。

環介導等溫核酸擴增技術(loop-mediated isotherm amplification,LAMP)是由Notomi于2000年開發的一種新型的恒溫核酸擴增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和兩對特殊的引物,特異地識別靶序列上的6個獨立區域，在等溫條件下(65℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。

膠體金核酸試紙條是依靠抗原與抗體的特異性結合，因此其具有極高的靈敏度。本發明將LAMP技術同膠體金核酸試紙條檢測結合起來，提供一種食品中綿羊源成分的快速靈敏檢測試劑盒。本發明無需復雜的儀器，時間短，操作簡單，靈敏度高，完全可以滿足現場檢測的需求。

發明內容

本發明的目的是提供用于檢測食品中綿羊源成分的綿羊源通用內標準基因。

本發明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、操作簡單的檢測食品中綿羊源成分的LAMP結合膠體金核酸試紙條檢測的快速檢測試劑盒。

一種用于檢測食品中綿羊源成分的基因，其為內標準基因Calponin，具有SEQ IDNO.1所示的序列。

本發明提供了上述內標準基因Calponin在檢測綿羊源成分中的應用。

本發明提供了上述內標準基因Calponin在食品中綿羊源成分鑒定中的應用。

本發明提供了一種用于檢測上述內標準基因Calponin的特異性LAMP引物組合，包括以下4條引物：

F3：5’-CTCACTCCTCTGACAGTCCT-3’(SEQ ID NO.2)；