[發明專利]一種從神經干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法及其用途

在審

• 申請號: 201910289370.4
• 申請日: 2019-04-11
• 公開（公告）號: CN109867718A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 王斌
• 申請（專利權）人: 南京鼓樓醫院
• 主分類號: C07K14/48
• 分類號: C07K14/48;C07K1/14;C12N5/0797;A61K38/18;A61P25/28
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

1.一種從神經干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟A：將胚胎干細胞在10CM細菌培養皿中以無血清培養基懸浮培養7-10天形成熟擬胚體，然后將成熟擬胚體打散、貼壁培養于一號Neurobasal培養基中，誘導其向神經干細胞定向分化，形成神經干細胞，然后將誘導而成的神經干細胞置于二號Neurobasal培養基中，選擇處于2-3代對數生長期的神經干細胞收集培養基；

步驟B：吸出二號Neurobasal培養基，將神經干細胞置于DMEM/F12培養基中繼續培養12小時，然后將細胞和培養基轉移至離心管進行離心處理，收集離心管中的上清，備用；

步驟C：將收集的上清分裝到離心管，每管15mL，然后將各離心管冷凍干燥，離心管里形成固體粉末；

步驟D：取每管冷凍干燥的粉末，采用1.5mL去離子水重新溶解，使用PD-10預裝脫鹽柱進行脫鹽純化，得到高蛋白濃度的洗脫液；

步驟E：重新收集洗脫液于離心管中，每管20mL，冷凍干燥成粉末，然后再用2mL去離子水重新溶解，得到高濃度的復合再生因子。

2.根據權利要求1所述的一種從神經干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法，其特征在于：所述步驟A中，一號Neurobasal培養基的具體配制為：每100mL的Neurobasal培養液中，添加1mL的B27和500ng的noggin。

3.根據權利要求1所述的一種從神經干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法，其特征在于：所述步驟A中，二號Neurobasal培養基的具體配制為：每100mL的Neurobasal培養液中，添加500ng的bFGF、1000ng的EGF5以及1mL的N2添加物。

4.根據權利要求1所述的一種從神經干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法，其特征在于：所述步驟A中，誘導形成的神經干細胞純度大于90％。

5.根據權利要求1所述的一種從神經干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法，其特征在于：所述步驟C中的離心處理具體是指：將細胞和培養基轉移至50mL離心管中，以3000rpm的速度離心10min。

6.根據權利要求1所述的一種從神經干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法，其特征在于，所述步驟D中脫鹽純化的具體步驟包括：

步驟D1：平衡，采用PBS平衡PD-10柱；

步驟D2：上樣，在PD-10柱平衡后，將溶解后的神經干細胞培養液加到柱子頂上；

步驟D3：洗脫：培養液全部進入柱子內后，從柱頂加入PBS以自然流速進行洗脫；

步驟D4：收集，從加樣開始計算，用1.5mL的EP管收集流出液為脫鹽蛋白峰，每管收集0.5mL；

步驟D5：檢測，采用BCA方法檢測每管總蛋白濃度，采用ELISA試劑盒檢測各管的特定再生因子濃度，將蛋白濃度比高于5ug/mL的樣品液合并后收集得到純化的洗脫液。

7.根據權利要求6所述的一種從神經干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法，其特征在于：所述步驟D5中，每15mL神經干細胞培養液可以收集2mL純化的洗脫液。

8.權利要求1所制備的神經干細胞來源的復合再生因子在中樞神經系統損傷中作為干細胞衍生治療藥物的應用。

9.一種用于中樞神經損傷的干細胞衍生治療藥物，其特征在于：其活性成分為采用權利要求1所述的方法而制備的神經干細胞來源的復合再生因子。