[發(fā)明專利]一種從神經(jīng)干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法及其用途

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910289370.4
• 申請日: 2019-04-11
• 公開（公告）號: CN109867718A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發(fā)明（設計）人: 王斌
• 申請（專利權）人: 南京鼓樓醫(yī)院
• 主分類號: C07K14/48
• 分類號: C07K14/48;C07K1/14;C12N5/0797;A61K38/18;A61P25/28
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

本發(fā)明提供一種從神經(jīng)干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法及其用途，人神經(jīng)干細胞由人胚胎干細胞系誘導分化而成，選擇第2?3代處于對數(shù)生長期的人神經(jīng)干細胞，收集干細胞培養(yǎng)基，進行高濃度的復合再生因子的制備。本發(fā)明人制備的神經(jīng)干細胞來源的再生因子在治療脊髓損傷中具有很好的應用前景，為有效治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，包括創(chuàng)傷性腦損傷，脊髓損傷等提供新選擇。

技術領域

本發(fā)明涉及干細胞再生修復領域，具體涉及一種從神經(jīng)干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法及其用途。

背景技術

中樞神經(jīng)系統(tǒng)包含大腦和脊髓，是所有感官知覺和運動輸出的中心。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復和再生能力非常有限，因為受損/軸突切割的神經(jīng)元和大多數(shù)橫切的中樞神經(jīng)軸突不可再生。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷包括創(chuàng)傷性腦損傷和脊髓損傷，是臨床上創(chuàng)傷性致死和致殘的主要原因。

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)和脊髓損傷(spinal cordinjury，SCI)神經(jīng)外科最常見的急危重癥之一，具有高發(fā)生率、高死亡率和高致殘率的特點，而且隨著社會的發(fā)展，其發(fā)生率呈逐年上升的趨勢。雖然近十年來其總體死亡率有所下降，但是仍有部分輕度患者會遺產生留永久的神經(jīng)功能障礙，中重度患者的致殘率甚至高達66％～100％，為社會和家庭帶來了極大的負擔。中樞神經(jīng)損傷目前還是一個世界性的醫(yī)學難題，究其原因是人們對中樞神經(jīng)損傷后再生修復機制并沒有完全了解。比如脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷可直接造成損傷部位的神經(jīng)元和膠質細胞機械性損傷，從而導致細胞死亡，其過程大致會持續(xù)數(shù)小時到數(shù)天。繼發(fā)性損傷則是脊髓損傷局部的細胞凋亡、大量炎癥細胞的浸潤導致的免疫炎癥反應、血管破壞導致的缺血、興奮性毒性、脂質過氧化與自由基損傷等最終導致的神經(jīng)元大量退化和死亡，殘存的神經(jīng)纖維脫髓鞘病變及水腫壞死等，造成損傷局部和周邊組織的大范圍神經(jīng)組織形態(tài)學和功能的改變。另外一個重要的方面是在損傷后多種病理變化導致的不利再生微環(huán)境，導致神經(jīng)營養(yǎng)因子比如BDNF,GDNF,NT-3等缺乏，從而進一步引起殘存神經(jīng)元缺乏足夠的生長因子維持，增加殘存神經(jīng)元的軸突的潰變，最后死亡。另外神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏也導致內源性神經(jīng)干細胞不能進行損傷的后的反應性增值和向功能神經(jīng)元的定向分化。

近年來，隨著對干細胞研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)干細胞能一定程度提高脊髓損傷修復效果。其機理主要為神經(jīng)干細胞旁分泌大量的神經(jīng)再生因子，比如BDNF，NT-3，GDNF，NGF等等，所以神經(jīng)干細胞移植其實主要以旁分泌的方式起作用。而且隨著體內移植的細胞的不斷死亡，分泌的因子濃度也逐漸減少。因此，需要研究出一種將體外培養(yǎng)的干細胞分泌到培養(yǎng)基中的眾多再生因子分離、濃縮的方法，然后將再生因子復合到生物材料上應用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復中。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目在于針對脊髓損傷修復或中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復的問題，提供一種從神經(jīng)干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法及其用途，為有效治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供新選擇。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案是：

本發(fā)明的第一方面，提供一種從神經(jīng)干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法。

一種從神經(jīng)干細胞來源的高濃度復合再生因子的制備方法，包括以下步驟：

步驟A：將胚胎干細胞在10CM細菌培養(yǎng)皿中以無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)7-10天形成熟擬胚體，然后將成熟擬胚體打散、貼壁培養(yǎng)于一號Neurobasal培養(yǎng)基中，誘導其向神經(jīng)干細胞定向分化，形成神經(jīng)干細胞，然后將誘導而成的神經(jīng)干細胞置于二號Neurobasal培養(yǎng)基中，選擇處于2-3代對數(shù)生長期的神經(jīng)干細胞收集培養(yǎng)基；

步驟B：吸出二號Neurobasal培養(yǎng)基，將神經(jīng)干細胞置于DMEM/F12培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12小時，然后將細胞和培養(yǎng)基轉移至離心管進行離心處理，收集離心管中的上清，備用；