[發明專利]一種鼠傷寒沙門氏菌回復株的構建方法

在審

• 申請號: 201910289219.0
• 申請日: 2019-04-11
• 公開（公告）號: CN109971782A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 劉永生;敬文憲;李學瑞;周建華;馬麗娜;陳啟偉
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 席勇

本發明提供一種鼠傷寒沙門氏菌回復株的構建方法，包括以下步驟：(1)構建鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株/pKD46；(2)構建鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株::kansacB/pKD46；(3)構建含有目的基因的線性基因打靶DNA片段；(4)將步驟(2)得到的鼠傷寒沙門氏菌缺失株::kansacB/pKD46制備成電轉感受態細胞，將步驟(3)制備的含有目的基因的線性基因打靶DNA片段轉入其中，37℃培養后，得到鼠傷寒沙門氏菌回復株。本發明通過對缺失基因進行原位回復，并以終止密碼子的同義替換為回復株標記，從而達到對目標基因進行高效回復的目的，使研究基因的功能更加的精細，準確。

技術領域

本發明涉及一種鼠傷寒沙門氏菌回復株的構建方法，可用于對常規方法改造的基因功能缺失株進行有效的回復。本發明通過對缺失基因進行原位回復，并以終止密碼子的同義替換為回復株標記，從而達到對目標基因進行高效回復的目的，使研究基因的功能更加的精細，準確。

背景技術

從基因型的改造觀察表型的改變已經成為研究基因功能的重要手段，基因編輯技術也是日新月異，從最初的長片段同源臂的同源重組系統，到短同源臂的red重組系統，再到目前熱門的crispr-cas9系統。但為了更有效的研究基因功能，對基因功能缺失株的基因功能恢復也成為了研究必不可少的一環。目前，對于回復株的構建主要依賴于表達目的基因質粒的導入，而目的基因的表達可借助于其本身的啟動子，形成自發性的表達回復，也可借助載體上的啟動子，進行誘導表達回復，但這兩種策略不管哪一種都會面臨一些問題，如靶基因表達量的問題，無法控制靶基因表達量就會導致回復株一些表型無法回復，或得出相反的結果，再如需要考慮回復質粒在宿主細胞中的穩定性，不穩定的存在并將導致回復實驗結果的不穩定。

發明內容

為解決以上構建回復株方法的弊端，本發明基于red重組系統，及點突變技術，建立了一種在靶基因原位進行回復的方法。為區分親本株與構建的回復株，本發明以靶基因終止密碼子的同義突變為標記，目的在于在保證標記的存在不影響靶基因的表達。

本發明提供一種鼠傷寒沙門氏菌回復株的構建方法，包括以下步驟：

(1)構建鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株/pKD46；

(2)構建鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株::kansacB/pKD46；

(3)構建含有目的基因的線性基因打靶DNA片段；

(4)將步驟(2)得到的鼠傷寒沙門氏菌缺失株::kansacB/pKD46制備成電轉感受態細胞，將步驟(3)制備的含有目的基因的線性基因打靶DNA片段轉入其中，37℃培養后，得到鼠傷寒沙門氏菌回復株。

作為優選，步驟(1)中，所述構建鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株/pKD46的具體方法為：將鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株制備成電轉感受態，將pKD46質粒電轉化入鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株的電轉感受態細胞。

作為優選，步驟(1)中，所述電轉化的條件為：2.3kV，2.5ms。

作為優選，步驟(2)中，所述構建鼠傷寒沙門氏菌缺失株::kansacB/pKD46的具體方法為：首先制備線性含有sacB和kan基因的打靶DNA片段，然后對鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株/pKD46和打靶DNA片段進行Red同源重組。

作為進一步優選，所述制備線性含有sacB和kan基因的打靶DNA片段的具體方法為：將Kan基因和sacB基因串聯，然后通過含有red同源重組系統通用打靶片段擴增引物的引物對串聯片段進行擴增，酶切連接轉化入感受態細胞，誘導表達，得到重組質粒，將所述重組質粒制備成線性打靶DNA片段。