[發明專利]一種鼠傷寒沙門氏菌回復株的構建方法在審
| 申請號： | 201910289219.0 | 申請日： | 2019-04-11 |
| 公開（公告）號： | CN109971782A | 公開（公告）日： | 2019-07-05 |
| 發明（設計）人： | 劉永生;敬文憲;李學瑞;周建華;馬麗娜;陳啟偉 | 申請（專利權）人： | 中國農業科學院蘭州獸醫研究所 |
| 主分類號： | C12N15/74 | 分類號： | C12N15/74 |
| 代理公司： | 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279 | 代理人： | 席勇 |
| 地址： | 730046 甘肅*** | 國省代碼： | 甘肅;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 鼠傷寒沙門氏菌 回復 構建 目的基因 基因打靶 制備 感受態細胞 終止密碼子 目標基因 缺失基因 同義替換 研究基因 電轉 精細 轉入 | ||
1.一種鼠傷寒沙門氏菌回復株的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：
(1)構建鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株/pKD46；
(2)構建鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株::kansacB/pKD46；
(3)構建含有目的基因的線性基因打靶DNA片段；
(4)將步驟(2)得到的鼠傷寒沙門氏菌缺失株::kansacB/pKD46制備成電轉感受態細胞，將步驟(3)制備的含有目的基因的線性基因打靶DNA片段轉入其中，37℃培養后，得到鼠傷寒沙門氏菌回復株。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：步驟(1)中，所述構建鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株/pKD46的具體方法為：將鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株制備成電轉感受態，將pKD46質粒電轉化入鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株的電轉感受態細胞。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于：步驟(1)中，所述電轉化的條件為：2.3kV，2.5ms。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：步驟(2)中，所述構建鼠傷寒沙門氏菌缺失株::kansacB/pKD46的具體方法為：首先制備線性含有sacB和kan基因的打靶DNA片段，然后對鼠傷寒沙門氏菌目的基因缺失株/pKD46和打靶DNA片段進行Red同源重組。
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于：所述制備線性含有sacB和kan基因的打靶DNA片段的具體方法為：將Kan基因和sacB基因串聯，然后通過含有red同源重組系統通用打靶片段擴增引物的引物對串聯片段進行擴增，酶切連接轉化入感受態細胞，誘導表達，得到重組質粒，將所述重組質粒制備成線性打靶DNA片段。
6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：步驟(3)中，所述構建含有目的基因的線性基因打靶DNA片段的具體方法為：將鼠傷寒沙門氏菌目的基因構建于pSGH398載體的BamH I酶切位點處，用引物對基因進行擴增，并應用DpnI酶進行酶切消除模板質粒的影響，再進行膠回收，即獲得線性基因打靶DNA片段。
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