[發明專利]一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法

在審

• 申請號: 201910287501.5
• 申請日: 2019-04-11
• 公開（公告）號: CN110156869A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 鄧春暉;李沂霖
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;B01J20/06;B01J20/28;B01J20/30
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 張磊

本發明提出一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法，具體步驟為：將磁性介孔雙金屬氧化物材料配置成分散液，和目標磷酸化肽段溶液混合加入上樣緩沖液中，37℃下孵育30?50分鐘，用上樣緩沖液洗滌材料，以0.4 M氨水作為洗脫緩沖液，將洗脫液點靶，進行質譜分析。本發明通過控制富集及洗脫條件實現對低豐度磷酸化肽的富集，結合MALDI?TOF MS或者nano?LC?MS/MS能夠實現同時大規模鑒定內源性磷酸化肽段，在翻譯后修飾肽組學中具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于新型磁性納米介孔吸附材料的制備，具體涉及一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法，尤其涉及一種基于雙金屬氧化物的磁性介孔納米材料選擇性富集提純內源性磷酸化肽的方法。

背景技術

人類腮腺分泌的唾液是人體最復雜、最重要的體液之一，具有潤滑口腔、幫助消化和抵抗感染等多種功能。因此，科學家認為唾液的變化，包括唾液中肽組學的變化，可以對多種疾病進行評估，如口干癥、糖尿病和口腔癌。此外，通過分泌途徑，內源性肽可以通過各種翻譯后修飾進行加工，包括糖基化、硫酸化和磷酸化。可逆磷酸化可以調節細胞信號傳導、分化和凋亡等多種生物學活性。因此，唾液內源性磷酸肽的研究在疾病生物標志物的發現中具有極為重要的前景。然而，在復雜的生物樣品中，內源性磷酸肽的豐度低、電離效率差，給直接用質譜法分析內源性磷酸肽帶來了很大的挑戰。因此，探索高效、特異的內源性磷酸肽富集方法是必不可少的。

到目前為止，已經發展了從復雜生物樣品中鑒定磷酸肽的多種富集策略，包括免疫沉淀法、離子交換色譜法（IEC）、金屬氧化物親和色譜法（MOAC）和固定化金屬離子親和色譜法（IMAC）。在這些策略中，由于金屬氧化物和位于磷酸化肽上的磷酸基團的特殊相互作用，MOAC是最常用的策略之一。然而，這些金屬氧化物（MOs）顯示出對于單磷肽和多磷肽的不同傾向，導致磷酸化肽識別的不充分性。因此，發展產生了大量的雙金屬氧化物，提高了對磷酸化肽的富集效率，從而使磷酸化肽的分析更為全面。然而，如果沒有合適的介孔，從含有高濃度蛋白質的復雜生物樣品中富集內源性磷酸肽幾乎不能實現。因此，有必要制備一種既具有多金屬氧化物親和位點又具有體積排斥能力的探針，以便于更有效的鑒定內源性磷酸肽。

發明內容

本發明的目的在于提出一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法。制備的新型磁性介孔雙金屬氧化物納米復合材料具有Zr-O和Ti-O雙重親和性、獨特的介孔結構和優異的磁響應性。與單金屬氧化物中心納米復合材料相比，雙金屬氧化物納米復合材料能更全面地識別單磷酸化肽和多磷酸化肽，具有較好的靈敏度。此外，新型磁性介孔雙金屬氧化物納米復合物也成功地用于富集人唾液中的內源性磷酸肽，這表明其在肽組學研究和疾病診斷方面的巨大潛力。本發明目的在于提供一種磁性介孔雙金屬氧化物復合納米材料的合成方法及其在內源性磷酸化肽段的富集純化中的應用。

本發明提供一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法，其富集分離的具體步驟如下：磁性介孔雙金屬氧化物材料與上樣緩沖溶液混合配置成材料分散液，取10-20μL該材料分散液和目標磷酸化肽段溶液加入上樣緩沖溶液中，在37℃下孵育30-60分鐘，用上樣緩沖溶液洗滌，用 0.4 M氨水作為洗脫緩沖液，將洗脫液點靶，進行質譜分析；

其中，磁性介孔雙金屬氧化物材料與上樣緩沖溶液的質量體積比為：10g：1l；

上樣緩沖液為含有體積比30%-60% 乙腈和體積比0.1% 三氟乙酸的緩沖溶液；

目標磷酸化肽段溶液為β-酪蛋白酶解液，材料分散液與目標磷酸化肽溶液體積比為：20：1-10000:1。

本發明中，磁性介孔雙金屬氧化物材料的合成步驟如下：

（1）將六水合三氯化鐵溶解于乙二醇中，至溶液澄清透明后加入無水醋酸鈉，經充分攪拌超聲后轉移至反應釜中，在100-450℃下加熱10-20小時，反應完畢后待反應釜冷卻至室溫，用去離子水和無水乙醇充分洗滌所得產物，于40-75℃下真空干燥；